PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCION SIMULTANEA DE VIROIDES MEDIANTE EL USO DE POLISONDAS.

Procedimiento para la detección simultánea de viroides mediante el uso de polisondas.

La patente consiste en la utilización de una polisonda para la detección de un número variable de secuencias nucleotídicas, mediante hibridación molecular. El sistema supone la clonación en tandem de varios fragmentos genómicos distintos en un mismo vector plasmídico lo cual permite la síntesis en la misma reacción de transcripción, de una única sonda de RNA o DNA. La invención reúne por un lado, la sensibilidad que confiere la hibridación molecular y por otro, permite disminuir los costes y el tiempo necesarios para la realización de los análisis. Es de aplicación principalmente en el campo del Fitodiagnóstico

Procedimiento para la detección simultánea de viroides mediante el uso de polisondas.

Sector de la técnica

La técnica se englobaría dentro del sector Agroalimentario y Biotecnológico con aplicaciones principalmente en el campo del Fitodiagnóstico y en la utilización de herramientas moleculares para la detección de organismos modificados genéticamente.

Estado de la técnica

Las especies cultivadas son susceptibles de sufrir un gran número de enfermedades virales que repercuten en su rendimiento y producción y que por tanto ocasionan importantes pérdidas económicas. En las infecciones ocasionadas por hongos y bacterias es posible un control de tipo químico para la erradicación de la enfermedad, pero en virus y viroides la principal estrategia de lucha contra el patógeno es el diagnóstico precoz; por lo que resulta de especial relevancia el desarrollo de métodos de detección sensibles, económicos y rápidos que permitan un diagnóstico fiable de la infección.

Los árboles frutales constituyen un cultivo de especial relevancia dentro del sector agroalimentario. Se conocen al menos 10 virus que afectan de manera significativa a estos cultivos y que pueden detectarse de manera individualizada por métodos serológicos y/o moleculares.

Uno de los principales objetivos actuales en el campo del Diagnóstico Molecular consiste en economizar en la medida de lo posible el análisis rutinario de gran número de muestras. Esto es válido tanto para el fitodiagnóstico de virus vegetales como en la detección de genes o transgenes en productos de alimentos.

Así, sería aconsejable encontrar un método de detección lo suficientemente sensible, rápido, económico y susceptible de automatización, que permita la detección simultánea del mayor número de virus posible y facilite por tanto el trabajo en los programas de certificación de frutales y de otras plantas cultivadas en general y por otro el control de las partidas en el caso de alimentos.

Los virus de plantas se componen de dos tipos de moléculas: informativas (ácidos nucleicos) y funcionales (proteínas) y los métodos de diagnosis se han ido desarrollando en base al progreso obtenido en la detección de ambos tipos de moléculas. Hasta hace relativamente poco tiempo, para la detección de virus de plantas, sólo se utilizaban de forma rutinaria los métodos basados en el componente proteico. Entre ellos, la técnica serológica más utilizada por su sencillez, sensibilidad y fácil automatización, ha sido el ensayo tipo ELISA. Sin embargo y en detrimento de su sensibilidad, este método presenta la desventaja de que sólo un 2-5% de la secuencia del virus actúa como determinante antigénico (Hull, R.; The potential for using dot-blot hybridisation in the detection of plant viruses. In Developments and applications of virus testing, ed. R.A.C. Jones, L. Torrance. pp. 3-12, Suffok, Lavenham, 1986).

Durante los últimos años y gracias a la incorporación de la tecnología del DNA recombinante a la Virología Vegetal, ha sido posible el desarrollo de métodos de diagnóstico basados en el componente genómico de los virus, entre los que cabe destacar dos técnicas: la hibridación molecular y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta técnica es también la base de los sistemas de detección de plantas o alimentos transgénicos. En este último caso los métodos de diagnóstico pueden estar basados en la detección de la secuencia del transgen introducido y en el caso de mezclas o alimentos elaborados, de la presencia o no de secuencias de nucleótidos que controlan la expresión y selección de transgenes, siendo las más habituales las secuencias representativas del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, la secuencia de poliadenilación del gen de la síntesis de nopalina y los genes de resistencia a ampicilina, kanamicina y tetraciclina. También sería útil en sistemas de discriminación de muestras en procesos de mejora genética por identificación de genes o marcadores, en identificación varietal o de especies, etc.

La hibridación molecular como método de diagnóstico en Virología Vegetal fue utilizada por primera vez para la detección de viroides (Owens, R.A. and Diener, T.O. (1981) Sensitive and rapid diagnosis of Potato spindle tuber viroid disease by nucleic acid hybridization. Science 213, 670-672.) y posteriormente para la de virus vegetales (Maule A.J., Hull R, Donson J. (1983) The application of spot hybridization to the detection of DNA and RNA viruses in plant tissues. J. Virol. Methods. 6, 215-24.; Garger S.J., Turpen, T., Carrington, J.C., Morris, T.J., Dodds, J.A., Jordan, R.L. and Grill, L.K. (1983). Rapid detection of plant RNA viruses by dot blot hybridization. Plant. Mol. Biol. Rep. 1, 21-25.). Esta técnica se basa en la complementariedad de las dos cadenas constituyentes de un ácido nucleico bicatenario y el resultado es la formación de un híbrido entre la secuencia de nucleótidos del virus a detectar y una secuencia complementaria marcada a la que se denomina sonda (Pallás, V., Más, P. and Sánchez-Navarro, J.A., (1998a). Detection of plant RNA viruses by non-isotopic dot-blot hybridization. In: Plant virus protocols: from virus isolation to transgenic resistance. Methods in Molecular Virology. Humana Press, Totowa. 81, 461-468). Para la síntesis de la sonda, el RNA viral es retrotranscrito y amplificado por PCR obteniéndose un DNA de doble cadena copia del genoma viral. Dicho fragmento se clona en un plásmido que contiene los promotores de dos RNA polimerasas, una permitirá la síntesis de RNA viral de polaridad positiva y la otra la del de polaridad negativa. Para el marcaje de la sonda se pueden utilizar precursores radiactivos o no radiactivos en la reacción de transcripción. Los últimos hacen de la hibridación molecular una técnica más accesible facilitando en gran medida su manejo. Entre los precursores no radiactivos los más comunes son los derivados de la biotina y de la digoxigenina. En la presente propuesta se ha utilizado la digoxigenina, un hapteno que se incorpora a los residuos de uridina mediante métodos enzimáticos convencionales y cuya detección se lleva a cabo con un anticuerpo específico.

La variante que más comúnmente se utiliza en hibridación molecular es la de 'dot-blot' en la que la solución de ácidos nucleicos es aplicada directamente sobre un soporte sólido, como por ejemplo una membrana de nitrocelulosa o nylon, y detectada con una sonda específica marcada.

La segunda técnica, el PCR, utiliza un enzima con capacidad para amplificar de forma exponencial secuencias específicas de DNA, lo cual requiere de un paso previo de retrotranscripción reversa (RT) en los virus de RNA, para la obtención de un DNA copia del genoma viral (Pallás, V., Sánchez-Navarro, J.A., Más, P., Cañizares, M. C., Aparicio, F., and Marcos, J. F. (1998b). Molecular diagnostic techniques and their potential role in stone fruit certification schemes. Options Méditerr. 19, 191-208), mientras que en alimentos esta paso no es necesario pues lo que se detecta directamente es el DNA genómico presente en la muestra. Se trata de un método extremadamente sensible y que por tanto permite detectar concentraciones extraordinariamente bajas del patógeno o del transgen. Esta alta sensibilidad hace que se sobredimensionen las pequeñas contaminaciones y que por tanto se requieran unas condiciones de trabajo muy estrictas no disponibles en laboratorios poco especializados.

La incorporación de los métodos moleculares ha supuesto una espectacular mejora de la sensibilidad. La elección de uno u otro método dependerá del tipo de análisis. No obstante, en los programas de certificación de frutales podría aceptarse como norma general el uso de métodos serológicos o la hibridación molecular no radiactiva, mientras que el PCR sería utilizado en análisis que requieran de una mayor sensibilidad como es el caso de las plantas madre, material prebásico, material importado, yemas durmientes durante el periodo de cuarentena o para fines sanitarios. En el caso de alimentos, en el control de materias primas en la recepción de fábrica o en pequeños laboratorios de análisis que confirmen la presencia o no de transgenes, mezcla de diferentes productos o especies, o la presencia o no de bacterias y hongos productores de toxinas o contaminantes, para asegurar la trazabilidad del alimento como libre de transgénicos, o de contaminantes o que no se trata de un sucedáneo o una mezcla de productos de inferior calidad, se utilizará la hibridación molecular. Sin embargo cuando se requiera un análisis más fino o de confirmación...

1. Procedimiento para la detección simultánea de diferentes secuencias de viroides caracterizado por el uso de polisondas con las siguientes características

a. comprenden más de un fragmento de DNA/RNA (al menos dos),

b. los fragmentos de a) se hayan fusionados en tandem o flanqueados por ciertas secuencias separadora

c. sintetizadas en una única sonda de DNA o RNA, a partir de un único vector plasmídico, y

d. su detección se realiza mediante hibridación complementaria con secuencias de viroides.

2. Procedimiento para la detección simultánea de diferentes secuencias de ácidos nucleicos según la reivindicación 1 caracterizado porque los fragmentos de DNA/RNA fusionados tienen cada uno al menos 50 pares de bases, preferentemente aunque 200 pares de bases para obtener una mayor sensibilidad.

3. Procedimiento para la detección simultánea de diferentes secuencias de ácidos nucleicos según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque la polisonda es capaz de detectar las secuencias representativas de más de un virus presente en un grupo de plantas.

4. Procedimiento para la detección simultánea de diferentes secuencias de ácidos nucleicos según la reivindicación 3 caracterizado porque la polisonda es capaz de detectar las secuencias representativas de los principales virus que afectan a frutales de hueso en cultivos comerciales.

5. Procedimiento para la detección simultánea de diferentes secuencias de ácidos nucleicos según las reivindicaciones 1 a 2 caracterizado porque la polisonda es capaz de detectar las secuencias representativas de más de un viroide presente en un grupo de plantas.

6. Procedimiento para la detección simultánea de diferentes secuencias de ácidos nucleicos según las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque la polisonda es capaz de detectar las secuencias representativas viroide del mosaico latente del melocotonero (Peach latent mosaic viroid, PLMVd) SEQ ID 1 y la secuencia representativa del viroide del enanismo del lúpulo (Hop stunt viroid, HSVd) SEQ ID2.

7. Procedimiento para la detección simultánea de diferentes secuencias de ácidos nucleicos según la reivindicación 6 caracterizado porque se realiza a partir de la pareja de oligonucleótidos específicos del viroide del mosaico latente del melocotonero (Peach latent mosaic viroid, PLMVd) SEQ ID 3 y 4 y mediante la pareja de oligonucleótidos específicos del viroide del enanismo del lúpulo (Hop stunt viroid, HSVd) SEQ ID 5 y 6.

8. Secuencia de nucleótidos denominada polisonda caracterizada porque según las reivindicaciones 1 a 7 está constituida por más de un fragmento de DNA/RNA (sonda individual) fusionados en tandem o flanqueados por ciertas secuencias separadoras, en un único vector plasmídico, que mediante hibridación complementaria detectan al menos una secuencia de ácidos nucleicos correspondiente a patógenos como viroides.

9. Secuencia de nucleótidos denominada polisonda según la reivindicación 8 caracterizada porque está constituida por fragmentos fusionados de DNA/RNA, cada uno con un tamaño mínimo de 50 pares de bases, preferentemente 200 pares de bases para obtener una mayor sensibilidad.

10. Secuencia de nucleótidos denominada polisonda según las reivindicaciones 8 caracterizada porque incluye las secuencias capaces de detectar el genoma de de más de un viroide presente en un grupo de plantas.

11. Secuencia de nucleótidos denominada polisonda según las reivindicaciones 8 a 10 caracterizada porque incluye las secuencias capaces de detectar el viroide del mosaico latente del melocotonero (Peach latent mosaic viroid, PLMVd) y el viroide del enanismo del lúpulo (Hop stunt viroid, HSVd).

12. Secuencia de nucleótidos denominada polisonda según las reivindicaciones 8 a 12 caracterizada porque incluye las secuencias capaces de detectar la SEQ ID 1 secuencia representativa del viroide del mosaico latente del melocotonero (Peach latent mosaic viroid, PLMVd) y la SEQ ID2 secuencia representativa del viroide del enanismo del lúpulo (Hop stunt viroid, HSVd).

13. Kit de detección de secuencias de nucleótidos de muestras vegetales o animales caracterizado por contener las secuencias y realizarse mediante el procedimiento indicados en las reivindicaciones 1 a 12.

14. Uso del procedimiento según la reivindicaciones 1 a 13 para el control de contaminaciones por viroides que contenga secuencias de ácidos nucléicos diferenciadoras tanto en muestras vegetales como animales.

15. Uso del procedimiento según las reivindicaciones 1 a 14 para el control de contaminaciones de patógenos de plantas en viveros, empresas productoras de plantas madre y centros de certificación sanitaria.