La presente invención se refiere a un método para la detección e identificación de las especies Pagrus pagrus,

Pagrus auriga y Diplodus sargus, mediante el empleo de técnicas PCR para la amplificación de la secuencia de la región ITS-1 del gen ribosómico ADNr 45S. Asimismo, se contemplan las secuencias aisladas de la región ITS-1 de dichas especies, no descritas anteriormente, así como los oligonucleótidos para la amplificación de dichas secuencias. Finalmente, la invención se refiere a un kit para la realización del método de la invención.

Método para la detección e identificación de especies de la familia Sparidae.

Campo de la invención

La presente invención se refiere, en sentido amplio, al análisis genético de diferentes especies de la familia Sparidae a través de cebadores específicos y en concreto a un método para la detección e identificación de las especies Pagrus pagrus, Pagrus auriga y Diplodus sargus, mediante el empleo de técnicas PCR para la amplificación de la secuencia de la región ITS-1 del gen ribosómico ADNr 45S de dichas especies.

Antecedentes de la invención

La familia Sparidae comprende unas 125 especies distribuidas en 37 géneros (Accioly I. V., and Molina W. F. (2008). Cytogenetic studies in Brasilian marine Sciaenidae and Sparidae fishes (Perciformes). Genetics and Molecular Research 7: 358-370), de ellas aproximadamente 24 especies (10 géneros) están descritas en el Atlántico noreste y el Mediterráneo (De la Herrán R., Ruiz Rejón C., Ruiz Rejón M., and Garrido-Ramos M. A. (2001). The molecular phylogeny of the Sparidae (Pisces, Perciformes) based on two satellite DNA families. Heredity 87: 691-697).

Los miembros de esta familia están ampliamente distribuidos por aguas tropicales y templadas en los Océanos Pacífico, índico y Atlántico; así como por los mares europeos, sobre todo el Mediterráneo (Accioly & Molina, 2008; Cataudella S., Perin Riz P., and Sola L. (1980). A chromosome study of eight mediterranean species of Sparidae (Pisces, Perciformes). Genética 54: 155-159). En concreto, la especie Pagrus pagrus se distribuye a lo largo de las dos costas Atlánticas, por el oeste se encuentra desde las costas de EEUU hasta Argentina, incluyendo el Golfo de México y las aguas del Caribe. Por el Atlántico este se encuentra desde las Islas Británicas hasta las costas de Senegal, incluyendo todo el Mediterráneo, las Islas Madeira y Canarias. Mientras, Pagrus auriga coincide con P. pagrus en las costas del Atlántico este, desde Portugal hasta Angola, incluyendo también el Mediterráneo, Islas Madeira y Canarias (Bauchot M. L., and Hureau J. C. (1986). Sparidae. In "Fishes of the North-Eastern Atlantic and the Mediterranean" (M. L. B. P. J. P. Whitehead, J. C. Hureau, J. Nielsen, and E. Tortonese, Ed.), UNESCO, Paris). De la misma forma, Diplodus sargus se distribuye a lo largo de las costas del Atlántico este, desde Francia hasta Angola, incluyendo también el Mediterráneo y las Islas Madeira, Canarias y Azores. Los espáridos poseen un enorme valor comercial y económico, tanto desde el punto de vista de la pesca extractiva como desde el de la acuicultura. Tanto el pargo (Pargus pargus), la urta (Pargus auriga) y el sargo (Diplodus sargus) alcanzan precios muy elevados en los mercados y son especies prioritarias para la diversificación de la acuicultura.

Los problemas taxonómicos evidentes dentro de la familia Sparidae, la amplitud de sus hábitats y su elevado interés comercial, hacen necesaria la búsqueda de marcadores moleculares que permitan identificar especies o diferenciar entre poblaciones de una misma especie.

En este sentido, las familias multigénicas del ADN ribosómico han demostrado ser eficaces para este objetivo en otras especies de peces, como en el género Brycon (Wasko A. P., Martins C., Wright J. M., and Galetti Jr P. M. (2001). Molecular organization of 5S rDNA in fishes of the genus Brycon. Genome 44: 893-902), en salmónidos (Pendás A. M., Morán P., Martínez J. L., and García-Vásquez E. (1995). Applications of 5S rDNA in Atlantic salmón, brow trout, and in Atlantic salmón x brown trout hybrid identification. Molecular. Ecol. 4: 275-276), en cíclidos (Booton G. C., Kaufman L., Chandler M., Oguto-Ohwayo R., Duan W., and Fuerst P. A. (1999). Evolution of the ribosomal RNA Internal Transcribed Spacer One (ITS-1) in Cichlid fishes of the Lake Victoria region. Molecular Phylogenetics and Evolution 11: 273-282), en lenguados (Manchado M., Zuasti E., Cross I., Merlo A., Infante C., and Rebordinos L. (2006a). Molecular characterization and chromosomal mapping of the 5S rRNA gene in Solea senegalensis: a new linkage to the U1, U2, and U5 small nuclear RNA genes. Genome; M. Manchado, L. Rebordinos and C. Infante (2006b). U1 and U2 small nuclear RNA genetic linkage: a novel molecular tool for identification of six sole species (Soleidae, Pleuronectiformes). Journal of Agricultural and Food Chemistry 54: 3765-3767), o en escómbridos (Infante C., Blanco E., Zuasti E., Crespo A., and Manchado M. (2007). Phylogenetic differentiation between Atlantic Scomber colias and Pacific Scomber japonicus based on nuclear DNA sequences. Genética 130: 1-8; Manchado M., Infante C., and Catanese G. (2007). "Marcadores moleculares en especies marinas. Bases teóricas, tipos y aplicación al estudio de las relaciones filogenéticas, estructura poblacional y autentificación de melva (Auxis rochei)", Viceconsejería. Servicio de Publicaciones y Dilvulgación, Sevilla). Se han utilizado incluso para la identificación de especies en filetes de pescado ahumados (Carrera E. et al. "Differentiation of smoked Salmo salar, Oncorhynchus mykiss and Brama raii using the nuclear marker 5S rDNA" International Journal of Food Science and Technology (2000), 35, 401-406).

Salvo excepciones, como son algunos protozoos y hongos, los ADN ribosómicos de eucariotas se encuentran constituyendo dos familias multigénicas distintas cuyas unidades se repiten en tándem de cientos a miles de veces en el genoma nuclear: la familia representada por el ADN ribosómico 45S, que codifica para los genes ribosómicos 18S, 5.8S y 28S (26S en levaduras), y la familia representada por el gen 5S, que codifica para el ARN ribosómico 5S.

Ambas familias suelen encontrarse en cromosomas distintos. Cada uno de estos loci está constituido por repeticiones de estas unidades ribosómicas dispuestas en tándems.

La unidad 45S incluye, aparte de los mencionados genes, dos espaciadores internos que se transcriben denominados ITS (Internal Transcribed Spacers); el ITS-1, que separa los genes 18S y 5.8S, y el ITS-2, que separa los genes 5.8S y 28S.

Cada una de estas unidades se encuentra a su vez separada de la contigua por dos tipos de espaciadores: un espaciador externo que también se transcribe, ETS, (External Transcribed Spacer), que flanquea el gen 18S en su extremo 5' y al 28S en el 3', y otra secuencia, que en su origen se consideró como no transcrita, situada entre los 2 ETSs. Con posterioridad se ha comprobado que esta última secuencia se transcribe a niveles bajos en algunas especies y que está implicada en la regulación de la transcripción de los genes ribosómicos, por lo que se ha denominado IGS (Intergenic Spacer).

Las regiones espaciadoras no codificantes del gen ribosómico 45S (ITS-1, ITS-2 o IGS) han sido utilizadas en multitud de ocasiones como marcadores para diferenciar especies o incluso para vislumbrar la estructura poblacional de una misma especie, por lo que estas regiones de ADN se sitúan como excelentes marcadores moleculares para la identificación de especies.

Por otra parte, el creciente interés industrial hacia métodos rápidos ha conducido a la elaboración y aplicación de métodos basados en PCR-multiplex (PCR mediante el uso de múltiples cebadores) para la detección e identificación de especies utilizadas en elaboración de alimentos, por ejemplo identificación de materia prima a base de bonito (Wen-Feng Lin and Deng-Fwu Hwang "A multiplex PCR assay for species identification of raw and cooked bonito" Food Control 19 (2008) 879-885), detección de la adulteración de las especies de peces en la industria de restaurantes (Asensio L. et al. "Application of multiplex PCR for the identification of grouper meals in the restaurant industry" Food Control 19 (2008) 1096-1099), alimentos a base de carnes (Ghovvati S. et al. "Fraud identification in industrial meat products by multiplex PCR assay" Food Control 20 (2009) 696-699) y también para estudiar la seguridad alimentaria como la identificación de microbios patógenos en los alimentos (Germini A. et al. "Simultaneous detection of Escherichia coli 0175:H7, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes by multiplex PCR" Food Control 20 (2009) 733-738) y cereales genéticamente modificados (Forte V.T. et al. "A general multiplex-PCR assay for the general detection of genetically modified soya and maize" Food Control 16 (2005) 535-539).

Los autores de la presente invención han secuenciado por... [Seguir leyendo]

1. Método para la detección e identificación simultánea en una muestra de al menos una de las especies de la familia Sparidae seleccionada entre Pagrus pagrus, Pagrus auriga y Diplodus sargus, mediante la amplificación por PCR de la secuencia de la región espadadora ITS-1 del gen ribosómico 45S de al menos una de esas especies.

2. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque la amplificación se lleva a cabo mediante PCR multiplex.

3. Método, según la reivindicación 1, donde las secuencias de la región espadadora se seleccionan entre SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3.

4. Método, según la reivindicación 3, donde la amplificación de la SEQ ID NO 1 se lleva a cabo mediante el empleo del par de cebadores de secuencias SEQ ID NO 4 y 7.

5. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque el empleo de la combinación de cebadores de secuencias SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO 7, permite la amplificación de un fragmento de la región espaciadora de 789 pb, específico de Pagrus pagrus.

6. Método según la reivindicación 3, donde la amplificación de la SEQ ID NO 2 se lleva a cabo mediante el empleo del par de cebadores de secuencias SEQ ID NO 5 y SEQ ID NO 7.

7. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque el empleo de la combinación de cebadores de secuencias SEQ ID NO 5 y SEQ ID NO 7, permite la amplificación de un fragmento de la región espaciadora de 644 pb, específico de Pagrus auriga.

8. Método según la reivindicación 3, donde la amplificación de la SEQ ID NO 3 se lleva a cabo mediante el empleo del par de cebadores de secuencias SEQ ID NO 6 y SEQ ID NO 7.

9. Método según la reivindicación 8, caracterizado porque el empleo de la combinación de cebadores de secuencias SEQ ID NO 6 y SEQ ID NO 7, permite la amplificación de un fragmento de la región espaciadora de 553 pb, específico de Diplodus sargus.

10. Molécula de ADN aislada que se corresponde con la secuencia de la región espaciadora ITS-1 no codificante del ADN ribosómico 45S de la especie Pagrus pagrus, mostrada en SEQ ID NO 1.

11. Molécula de ADN aislada que se corresponde con la secuencia de la región espaciadora ITS-1 no codificante del ADN ribosómico 45S de la especie Pagrus auriga, mostrada en SEQ ID NO 2.

12. Molécula de ADN aislada que se corresponde con la secuencia de la región espaciadora ITS-1 no codificante del ADN ribosómico 45S de la especie Diplodus sargus, mostrada en SEQ ID NO 3.

13. Oligonucleótido, con secuencia mostrada en SEQ ID NO 4, para su uso como cebador en la identificación de la especie Pagrus pagrus, según el método de la reivindicación 1.

14. Oligonucleótido, con secuencia mostrada en SEQ ID NO 5, para su uso como cebador en la identificación de la especie Pagrus auriga, según el método de la reivindicación 1.

15. Oligonucleótido, con secuencia mostrada en SEQ ID NO 6, para su uso como cebador en la identificación de la especie Diplodus sargus, según el método de la reivindicación 1.

16. Oligonucleótido, con secuencia mostrada en SEQ ID NO 7, para su uso como cebador en la identificación de las especies Pagrus pagrus, Pagrus auriga y Diplodus sargus, según el método de la reivindicación 1.

17. Kit para llevar a cabo el método de las reivindicaciones 1-9 que comprende una solución formada por el oligonuclóetido de secuencia SEQ ID NO 7 y al menos un oligonucleótido seleccionado de entre SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 y SEQ ID NO 6.

18. Empleo de la región ITS-1 del gen ribosómico 45S como marcador genético para la detección e identificación de especies de la familia Sparidae.