PROCEDIMIENTO GENETICO DE TIPIFICADO PARA DICENTRARCHUS LABRAX.
Procedimiento y kit para el genotipado de Dicentrarchus labrax.
La presente invención se refiere a un procedimiento para el genotipado de Dicentrarchus labrax que comprende: a) extraer una muestra de ADN de Dicentrarchus labrax; b) amplificar dicha muestra de ADN llevando a cabo al menos una PCR múltiplex en la que se utilizan al menos cinco pares de cebadores, seleccionándose dichos pares de cebadores del grupo que consiste en: SEC ID NO: 1,SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3- SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5- SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7-SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9- SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11-SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13- SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15-SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17-SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19- SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21-SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23-SEC ID NO: 24; y c) detectar por medios adecuados los fragmentos amplificados en la etapa (b).
La invención también se refiere a un kit para el genotipado de Dicentrarchus labrax
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200701558.
Solicitante: UNIVERSIDAD DE MALAGA.
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: MALAGA.
Inventor/es: PORTA PELAYO,JAVIER, PORTA PELAYO,JOSE MARIA, ALVAREZ HERRERO,MARIA CARMEN.
Fecha de Solicitud: 31 de Mayo de 2007.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 27 de Agosto de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/68M10
Clasificación PCT:
- C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Fragmento de la descripción:
Procedimiento genético de tipificado para Dicentrarchus labrax.
La presente invención está relacionada con la biología molecular. En particular, la presente invención se refiere a un procedimiento y kit para el genotipado de la especie de Dicentrarchus labrax que permiten, entre otros, determinar el pedigrí y el parentesco molecular de un individuo perteneciente a esta especie.
Estado de la técnica anterior
La acuicultura es uno de los sectores económicos con mayor avance en los últimos años. Entre las especies de mayor interés en Europa destaca la lubina, Dicentrarchus labrax (también abreviado como D. labrax).
El éxito de la acuicultura moderna se basa en el control sobre la reproducción de las especies, el mejor conocimiento de su biología, y en las innovaciones tecnológicas. Sin embargo, en el cultivo de Dicentrarchus labrax son muchas las dificultades que surgen en el control y manejo de los stocks reproductores, debido fundamentalmente al elevado número de individuos que se manejan, la dificultad para identificar a los padres o para identificar huevos o larvas en los primeros meses de desarrollo. Estos y otros aspectos imposibilitan un control integral de la reproducción de esta especie en cautividad (i.e., piscifactoría).
De la misma forma el control de la trazabilidad supone un reto para garantizar la seguridad alimenticia de los productos derivados de la explotación comercial de esta especie, tanto el criado en cautividad (piscifactoría) como el procedente del medio natural.
En la actualidad se puede encontrar en distintas bases de datos, abundante información sobre secuencias de ADN descritas para D. labrax. Esta información permite llevar a cabo el genotipado de individuos de formas muy variadas.
Sin embargo hasta la actualidad, no se ha estandarizado ningún procedimiento para llevar a cabo dicho genotipado para D. labrax. Por lo tanto, resulta deseable diseñar herramientas precisas que permitan genotipar los individuos de esta especie con el fin de controlar, mejorar y conservar esta especie, tanto en poblaciones criadas en cautividad así como en el medio natural.
Explicación resumida de la invención
Los inventores han desarrollado y automatizado un procedimiento genético de genotipado y su correspondiente kit para la especie piscícola de lubina Dicentrarchus labrax.
La presente invención proporciona una herramienta molecular que permite descifrar la huella genética de cada individuo, la cual permanece invariable a lo largo de su vida, e incluso una vez muerto. Además permite conocer la procedencia familiar de cada individuo y por tanto las relaciones de parentesco entre individuos y sus genealogías. Esta información permite controlar e incluso mejorar las características de los stocks reproductores de D. labrax.
De esta manera, la presente invención se refiere a un procedimiento para el genotipado de Dicentrarchus labrax que comprende: a) extraer una muestra de ADN de Dicentrarchus labrax; b) amplificar dicha muestra de ADN llevando a cabo al menos una PCR multiplex en la que se utilizan al menos cinco pares de cebadores, seleccionándose dichos pares de cebadores del grupo que consiste en: SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24; y c) detectar por medios adecuados los fragmentos amplificados en la etapa (b).
El genotipado consiste en caracterizar regiones determinadas del genoma (marcadores moleculares) de un individuo, para descubrir en él rasgos exclusivos (alelos) que lo distingan del resto de individuos de su especie. Para llevar a cabo el genotipado de un individuo mediante esta herramienta, se requieren concentraciones muy bajas de ADN (50 ng) que pueden obtenerse de una pequeña muestra que contenga células del individuo, tales como sangre, huevos, larvas, fragmentos de aleta, de tejidos de peces muertos o despiezados e incluso procesados. El resultado de este análisis en un individuo, constituye su seña de identidad más fiable.
El procedimiento de la presente invención permite la identificación de un individuo de entre millones con una altísima precisión. Además permite realizar estudios de pedigrí para identificar a los padres biológicos de un individuo y de forma escalonada obtener información sobre genealogías o poblaciones. Estas aplicaciones son fundamentales para el control y manejo de los stocks reproductores en la acuicultura de D. labrax, así como de su progenie, o bien para rastrear la trazabilidad de los individuos y asegurar así la salud alimenticia de los consumidores, entre otros.
Otras ventajas del procedimiento de la presente invención son: a) el procedimiento implementado de PCR múltiplex reduce el tiempo y coste de la técnica, minimizando el riesgo de errores de manejo, ya que se reduce considerablemente la manipulación; b) la metodología es sencilla, sólida y reproducible, asegurando unos resultados precisos; c) estandarización de los loci empleados y posible comparación de resultados de distintos trabajos realizados con esta herramienta; y d) los loci empleados en el procedimiento de la invención son altamente informativos.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un kit para el genotipado de Dicentrarchus labrax mediante el procedimiento de acuerdo con el primer aspecto de la invención, que comprende al menos cinco pares de cebadores para llevar a cabo al menos una PCR multiplex, seleccionándose dichos pares de cebadores del grupo que consiste en: SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24.
Estas herramientas se pueden emplear para controlar la estructura genética de los stocks y así mantener niveles de variabilidad acordes con una óptima eficiencia biológica, aplicar métodos de selección y/o facilitar un seguimiento preciso de los procesos de reproducción, cría, comercialización y trazabilidad. Este control de los stocks permitiría evitar posibles desastres ecológicos en las poblaciones naturales, tras posibles escapes o repoblación.
El kit de la presente invención se ha probado con excelentes resultados, en la identificación de individuos y determinación del pedigrí en individuos nacidos en una granja de lubinas, aspecto de singular importancia en el cultivo de peces ya que no es posible hacer un seguimiento de los reproductores que realmente participan en las puestas, a menos que se haga fecundación artificial. Además esta herramienta se ha probado en la caracterización genética de una población de 50 individuos procedentes del medio natural.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Explicación detallada de la invención
En la presente invención el término "PCR multiplex" se refiere a una variante de la reacción de la polimerasa en cadena en el que se coamplifican varios loci en una sola reacción.
En la presente invención el término "marcador molecular" se refiere a loci microsatélites (es decir, secuencias de ADN en el que se repiten un motivo de 2-7 nucleótidos en tándem) que se distribuyen de manera aleatoria a lo largo del genoma de los organismos. Este tipo de marcadores constituyen zonas muy variables, y por tanto distintas, de unos individuos a otros. Los marcadores moleculares en los que se basa el procedimiento de genotipado de la presente invención están disponibles en bases de datos públicas como la Genebank. En la siguiente tabla se adjunta información sobre el nombre del locus, nº de acceso a dicha base de datos y la secuencia de los cebadores empleados en la amplificación,...
Reivindicaciones:
1. Procedimiento para el genotipado Dicentrarchus labrax que comprende:
a) extraer una muestra de ADN de Dicentrarchus labrax;
b) amplificar dicha muestra de ADN llevando a cabo al menos una PCR multiplex en la que se utilizan al menos cinco pares de cebadores, seleccionándose dichos pares de cebadores del grupo que consiste en: SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24;
c) detectar por medios adecuados los fragmentos amplificados en la etapa (b).
2. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que la etapa (b) consiste en una PCR multiplex en la que se utilizan seis pares de cebadores.
3. Procedimiento según la reivindicación 2 en el que los seis pares de cebadores son: SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12.
4. Procedimiento según la reivindicación 2 en el que los seis pares de cebadores son: SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24.
5. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que la etapa (b) se lleva a cabo mediante una primera PCR multiplex con seis pares de cebadores seleccionados del grupo que consiste en: SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, y una segunda PCR multiplex con los seis pares de cebadores restantes que no han sido utilizados en la primera PCR multiplex.
6. Procedimiento según la reivindicación 5 en el que una de las PCR multiplex se lleva a cabo con el grupo de cebadores que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12 y la otra PCR multiplex se lleva a cabo con el grupo de cebadores que consiste en: SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24.
7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la reacción de PCR multiplex se lleva a cabo en las condiciones de: 5 minutos a 95ºC, 25 ciclos de 30 segundos cada uno a 95ºC, 30 segundos a 58ºC y 45 segundos a 72ºC, seguido de 7 minutos a 72ºC.
8. Procedimiento según la reivindicación 1 que comprende:
a) extraer una muestra de ADN de Dicentrarchus labrax;
b) amplificar dicha muestra de ADN llevando a cabo una PCR multiplex en la que se utilizan seis pares de cebadores: SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, en las condiciones de 5 minutos a 95ºC, 25 ciclos de 30 segundos cada uno a 95ºC, 30 segundos a 58ºC y 45 segundos a 72ºC, seguido de 7 minutos a 72ºC; y
c) detectar por medios adecuados los fragmentos amplificados en la etapa (b).
9. Procedimiento según la reivindicación 1 que comprende:
a) extraer una muestra de ADN de Dicentrarchus labrax;
b) amplificar dicha muestra de ADN llevando a cabo una PCR multiplex en la que se utilizan seis pares de cebadores: SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, en las condiciones de 5 minutos a 95ºC, 25 ciclos de 30 segundos cada uno a 95ºC, 30 segundos a 58ºC y 45 segundos a 72ºC, seguido de 7 minutos a 72ºC; y
c) detectar por medios adecuados los fragmentos amplificados en la etapa (b).
10. Procedimiento según la reivindicación 1 que comprende:
a) extraer una muestra de ADN de Dicentrarchus labrax;
b) amplificar dicha muestra de ADN llevando a cabo una primera PCR multiplex con seis pares de cebadores seleccionados del grupo que consiste en: SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24 y una segunda PCR multiplex con los seis pares de cebadores restantes no utilizados en la primera PCR multiplex, llevándose a cabo las dos PCR multiplex en las condiciones de 5 minutos a 95ºC, 25 ciclos de 30 segundos cada uno a 95ºC, 30 segundos a 58ºC y 45 segundos a 72ºC, seguido de 7 minutos a 72ºC; y
c) detectar por medios adecuados los fragmentos amplificados en la etapa (b).
11. Procedimiento según la reivindicación 10 en el que las dos PCR multiplex se llevan a cabo de manera secuencial.
12. Procedimiento según la reivindicación 10 en el que las dos PCR se llevan a cabo simultáneamente.
13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la etapa (c) comprende:
14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que al menos uno de cada par de cebadores está marcado con una etiqueta de fluorescencia.
15. Kit para el genotipado de Dicentrarchus labrax mediante el procedimiento definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-14, que comprende al menos cinco pares de cebadores para llevar a cabo al menos una PCR multiplex, seleccionándose dichos pares de cebadores del grupo que consiste en: SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24.
16. Kit según la reivindicación 15 que comprende los siguientes pares de cebadores para llevar a cabo una PCR multiplex: SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12.
17. Kit según la reivindicación 15 que comprende los siguientes pares de cebadores para llevar a cabo una PCR multiplex: SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24.
18. Kit según la reivindicación 15, que comprende un primer grupo de pares de cebadores que consiste en: SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, y un segundo grupo de pares de cebadores que consiste en: SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24 para llevar a cabo dos PCR multiplex de manera secuencial o simultánea.
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