Procedimiento para la identificación genética de la centolla europea del Atlántico (Maja brachydactyla).

Se ha desarrollado un protocolo para la identificación genética de la centolla europea del Atlántico (Maja brachydactyla) frente a las demás especies del género que se encuentran en el Mediterráneo (M. squinado, M. crispata y M. goltziana). Estas especies constituyen un recurso comercial de gran valor; su identificación es fundamental para posibilitar su trazabilidad y correcto etiquetado y para orientar su gestión y conservación.El protocolo consiste en amplificar una región de 671 pb del gen 16S del ADN mitocondrial, cuya secuencia nucleotídica es característica de cada una de las 4 especies. En particular, para diferenciar M. brachydactyla se han diseñado cebadores específicos que permiten amplificar un fragmento interno de 223 pb

Procedimiento para la identificación genética de la centolla europea del Atlántico (Maja brachydactyla).

Sector de la técnica

La centolla es un recurso pesquero muy importante en Europa y, como tal, una exigencia básica de mercado es la autentificación de su origen y su correcto etiquetado. Además, se está explotando de forma intensiva y, de hecho, en el Mediterráneo, la especie más comercializada ya se considera amenazada. Por eso también es fundamental la identificación de estas especies para desarrollar programas de recuperación y repoblación, de modo que se asegure la incorporación correcta de cada especie en su área de distribución geográfica.

Estado de la técnica

La centolla es uno de los crustáceos de mayor importancia económica en las costas europeas. Pertenece al género Maja y en esta región se han definido cuatro especies: M. brachydactyla, M. squinado, M. crispata y M. goltziana (Neumann 1998), si bien el interés comercial se centra en las dos primeras. M. brachydactyla se distribuye en el Atlántico (desde el sur del Mar del Norte hasta Senegal) mientras que M. squinado es endémica del Mediterráneo. M. crispata y M. goltziana fueron descritas inicialmente tanto en el Atlántico (desde el oeste de Portugal hasta el Golfo de Guinea) como en el Mediterráneo, aunque los registros recientes corresponden al Mediterráneo (Carmona-Suárez 2003, Fürböck y Patzner 2005; Soppelsa et al. 2005, Lelli et al. 2007).

La diferenciación de estas especies es muy complicada, especialmente en el caso de M. brachydactyla y M. squinado; se basa en una serie de caracteres morfológicos como la forma de los primeros gonópodos, la forma de las espinas del caparazón (y su disposición) y varias medidas morfométricas (Neumann 1998). Sin embargo, estas diferencias no son definitivas, son apreciables sólo por expertos y tienen el inconveniente añadido de que cambian a lo largo de la vida del individuo (no se observan en estado larvario y varían entre juveniles y adultos). Por este motivo, las centollas pescadas en el Atlántico (M. brachydactyla, según Neumman) son todavía etiquetadas en los mercados como M. squinado.

Desde el punto de vista comercial, las capturas de centolla superaron las 5000 toneladas en el año 2005 (según los últimos datos disponibles de la FAO); y, siendo un producto muy apreciado en el mercado, alcanza además precios elevados. Se pesca casi exclusivamente en el litoral Atlántico, mientras que en el Mediterráneo es cada vez más difícil de encontrar. De hecho, en algunas zonas del Mediterráneo, M. squinado se considera una especie amenazada. Por estos motivos, se está desarrollando el cultivo en cautividad, tanto para abastecer a los mercados y paliar la sobreexplotación de las poblaciones naturales como para repoblar y recuperar las áreas más afectadas.

Para resolver los problemas de identificación, hemos llevado a cabo un estudio genético con marcadores de ADN mitocondrial: un fragmento de 710 pb del gen COI y un fragmento de 560 pb del gen 16S (Sotelo et al. 2008), confirmando el estatus de especie de cada una de las formas propuestas.

En este estudio concluimos además que el fragmento de 16S es un marcador idóneo para la identificación de estas centollas, por ser invariable dentro de especie y variable entre especies. Conociendo la secuencia nucleotídica de estos fragmentos, es posible asignar una muestra de centolla europea de forma inequívoca a una de las cuatro especies. La ventaja de la identificación genética es su validez en cualquier etapa del desarrollo del individuo, desde larva a adulto, y su aplicación sobre una pequeña cantidad de tejido del individuo analizado, por lo que no es necesario disponer del individuo completo.

Aunque la secuenciación del fragmento del 16S es un buen método de identificación, hemos diseñado un protocolo de asignación molecular más rápido y sencillo, pero igualmente eficaz. El principal objetivo es la identificación de M. brachydactyla frente a M. squinado, ya que estas dos especies de centolla son las más parecidas morfológicamente y de mayor interés comercial. Sin embargo, para evitar cualquier posible confusión con las demás especies del Mediterráneo, éstas también se han incluido a la hora de desarrollar la técnica.

Bibliografía

Carmona-Suárez CA (2003) Reproductive biology and relative growth in the spider crab Maja crispata (Crustacea: Brachyura: Majidae). Scientia Marina 67: 75-80

Fürböck S, Patzner RA (2005) Daily movement patterns of Maja crispata Risso 1827 (Brachyura: Majidae) Acta Adriatica 46: 41-45

Lelli S, Carpentieri P, Colloca F, Ardizzone GD (2007) The spiny spider crab Maja gotziana (Crustacea: Majidae) in south Lebanese waters. JMBA2-Biodiversity Records (Published on-line)

Neumann V (1998) A review of the Maja squinado (Crustacea: Decapoda: Brachyura) species-complex with a key to the eastern Atlantic and Mediterranean species of the genus. Journal of Natural History 32: 1667-1684

Soppelsa N, Zenetos A, Papathanassiou E (2005) Maja goltziana d'Oliveira, 1888 (Decapada, Brachyura, Majidae) in the southern Tyrrhenian Sea. Crustaceana 78: 121-124

Sotelo G, Moran P, Posada D (2008) Genetic identification of the northeastern Atlantic spiny spider crab as Maja brachydactyla Balss, 1922. Journal of Crustacean Biology 28: 76-81.

Explicación de la invención

El objetivo de la invención es la identificación genética inequívoca de la especie europea de centolla del Atlántico frente a las del Mediterráneo. La invención se basa en la amplificación de un fragmento de 671 pb del gen 16S del ADN mitocondrial, para el que ya había cebadores disponibles con anterioridad, y en el estudio de las diferencias en la secuencia entre las 4 especies de centolla. Teniendo en cuenta estas diferencias, se han diseñado cebadores específicos para un fragmento interno de 223 pb en M. brachydactyla. Así, ante una muestra de centolla europea, habiendo amplificado el fragmento mayor de referencia, si amplifica también el fragmento menor, podremos identificarla como M. brachydactyla. En caso contrario, sabremos que procede del Mediterráneo.

Descripción detallada de la invención (forma de realización)

El procedimiento para la identificación genética de la especie europea del género Maja (centollas) del Atlántico, M. brachydactyla, frente a las especies del mismo género del Mediterráneo, M. squinado, M. crispata y M. goltziana, consta de las siguientes etapas:

1- Extracción de ADN

Para extraer ADN se parte de una muestra de tejido de 0.5 cm³, de músculo preferentemente. Se han descrito muchos protocolos de extracción, pero uno de los más sencillos y rápidos es el que utiliza la resina quelante Chelex [Estoup et al. (1996) Mol Mar Biol Biotech 5: 295-298]. Consiste en homogeneizar el tejido en 400 μL de una solución de Chelex 100 (Bio Rad) al 10%. La solución debe mantenerse caliente y en agitación antes de tratar la muestra. Para potenciar la eliminación de proteínas, se añaden 30 μL de proteasa 20 mg/mL (Pronase, Roche) al homogeneizado. Éste se incuba primero a 60ºC durante 1 hora (en un baño de agua, con agitación) y después a 99ºC durante 15 minutos (en una estufa). Para que precipiten los restos de tejido, junto con la resina, y el ADN quede en el sobrenadante, se aplica una centrifugación final de 1 minuto.

Si la cantidad de muestra es limitante (si se trata de una larva, por ejemplo), el kit NucleoSpin Tissue (Macherey-Nagel) es más adecuado porque permite recuperar más ADN y de mejor calidad. En este caso, se siguen las instrucciones del fabricante.

Para comprobar la efectividad de la extracción, una alícuota de 4 μL se somete a electroforesis... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la identificación genética de la especie de centolla europea del Atlántico, Maja brachydactyla, frente a las especies del Mediterráneo, M. squinado, M. crispata y M. goltziana, caracterizado por consistir en:

a. Obtener una muestra para evaluar.

b. Extraer el ADN de la muestra.

c. Amplificar por PCR un fragmento de 671 pb del ADN mitocondrial con los cebadores 16L29 y 16HLeu (SEQ ID NO 1 y 2, respectivamente) y comprobar la correcta amplificación.

d. Amplificar por PCR un fragmento de 223 pb, incluido en la región anterior, con los cebadores específicos para M. brachydactyla 16Lbr y 16Hbr (SEQ ID NO 7 y 8, respectivamente). Comprobar la amplificación. Si es positiva, la muestra corresponde a M. brachydactyla. Si es negativa, a M. squinado, M. crispata o M. goltziana.

2. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que la muestra a evaluar procede de una centolla en cualquier etapa de desarrollo capturada en las costas europeas, del Atlántico o del Mediterráneo.