Método y kit para la detección del virus de la hepatitis E (VHE).

En la presente invención se describe una combinación de cebadores y un método para la detección molecular de las diferentes cepas circulantes del virus de la hepatitis E (VHE) en humanos y reservorios animales distribuidas geográficamente por todo el mundo. La amplificación del genoma del VHE se realiza mediante RT-PCRs anidadas donde los cebadores empleados amplifican dos fragmentos de las regiones ORF1 (Open Reading Frame) y ORF2 del genoma de este virus. Además, la presente invención incluye un kit con la combinación de los cebadores mencionados y otros componentes

Método y kit para la detección del virus de la hepatitis E (VHE).

En la presente invención se describe una combinación de cebadores y un método para la detección molecular de las diferentes cepas circulantes del virus de la hepatitis E (VHE) en humanos y reservorios animales distribuidas geográficamente por todo el mundo. La amplificación del genoma del VHE se realiza mediante RT-PCRs anidadas donde los cebadores empleados amplifican dos fragmentos de las regiones ORF1 (Open Reading Frame) y ORF2 del genoma de este virus. Además, la presente invención incluye un kit con la combinación de los cebadores mencionados y otros componentes.

Estado de la técnica anterior

La hepatitis E es una enfermedad causada por el virus VHE. Este virus no se ha podido reconocer específicamente hasta fechas recientes. Aún cuando se trate, realmente, de un virus que estuvo en el pasado muy bien asentado en las poblaciones humanas del Viejo Mundo, lo cierto es que el VHE es hoy en día un agente que sólo circula en forma significativa en las regiones económicamente más deprimidas, en las que constituye una causa frecuente de brotes epidémicos de hepatitis vírica aguda. La infección por el VHE es endémica en el centro y sudeste de Asia, y ha causado epidemias en Oriente Próximo, en el norte y oeste de África, y en México. La vía de transmisión fecal-oral es la predominante, y la mayoría de las epidemias conocidas se han relacionado con el consumo de aguas contaminadas con materia fecal (Ippagunta et al. (2007) J. Med. Virol. 79(12): 1827-31). La mortalidad general es baja, pero aumenta muy significativamente en las mujeres embarazadas.

A día de hoy, puede postularse que, en la Europa occidental, el VHE es un agente zoonótico que circula en algunas especies de animales de granja, y que se transmite al ser humano con una frecuencia difícil de precisar y por efecto de circunstancias aún poco conocidas.

Las pruebas de laboratorio utilizadas para el diagnóstico de la infección por el VHE incluyen la inmunomicroscopía electrónica (IME), los ensayos serológicos para la identificación de anti-VHE de las clases IgM e IgG, y las técnicas moleculares para detección del ARN viral en heces y en suero.

La IME permite detectar partículas virales directamente en las heces del paciente infectado. Esta técnica es muy específica, pero es costosa, laboriosa y poco sensible, por lo que no se utiliza con fines de diagnóstico.

El desarrollo de pruebas serológicas sensibles para la detección de anti-VHE ha permitido un análisis más completo de la epidemiología de esta infección a escala mundial. El diagnóstico serológico de la infección aguda se realiza por detección de IgM específica mediante enzimoinmunoanálisis (EIA), que puede confirmarse mediante inmunoblot recombinante (IBR). Los estudios de prevalencia se llevan a cabo mediante la detección de anti-VHE de la clase IgG, que se realiza, también, mediante EIA con confirmación por IBR.

Con todo, el grado de concordancia entre los resultados que se obtienen por diferentes pruebas para detección de anti-VHE sobre un mismo grupo de muestras es bajo (Mast et al. (1997) J. Infect. Dis. 176(1): 34-40), y no está claro hasta qué punto las reactividades que se obtienen en las pruebas de EIA en las áreas no endémicas reflejan la presencia real de anticuerpos frente al virus. La reciente disponibilidad de métodos de IBR introduce un valioso instrumento de confirmación, y su uso ha demostrado ya que parte de las reactividades que se registran por EIA no son específicas.

La infección aguda por VHE puede también diagnosticarse mediante detección del ARN viral en heces y suero mediante procedimientos de amplificación genómica (patentes WO9919732, WO2001046696, JP2005102689 y CN1300771). Estas pruebas rinden resultados positivos entre 6 y 40 días, en este tipo de muestras, después de la exposición al virus, algunos días antes de que se observe la elevación de los niveles séricos de transaminasas y la aparición de los anticuerpos específicos. En ocasiones, estas técnicas de diagnóstico molecular rinden resultados positivos en casos que no se detectan mediante las de diagnóstico serológico, lo que abre la posibilidad de que estas últimas puedan no ser adecuadas para detectar infecciones por ciertas variantes del VHE. Por último, las técnicas de amplificación genómica facilitan, además del diagnóstico etiológico, un material útil para obtener otra información que la serología no puede facilitar, como es la identificación del genotipo viral involucrado en la infección y la posibilidad de realizar estudios filogenéticos que comparen entre sí las cepas procedentes de casos distintos.

En los virus cuyo material genético es ARN (como es el caso del VHE), los genomas se replican con una tasa de error varios órdenes de magnitud superior a la del ADN celular.

En la presente invención, a la hora de diseñar los cebadores degenerados para llevar a cabo la amplificación genómica, se han tenido en cuenta la gran variabilidad de cepas existentes en todo el mundo descritas desde 1987 hasta la fecha actual, incluyendo cepas representantes de los 4 genotipos descritos en humanos y animales, así como cepas de distinta procedencia geográfica para cada uno de ellos.

Esta es una importante diferencia con respecto a otros métodos que pudieran utilizar cebadores similares a los de la presente invención, ya que utilizar cebadores diseñados a partir de tan pocas secuencias, y sobre todo no actualizadas, hace muy probable que algunas de las nuevas variantes que se generan a lo largo del tiempo puedan no ser detectadas con los métodos descritos hasta hoy.

Explicación de la invención

En la presente invención se describe una combinación de cebadores y un método para la detección molecular de las diferentes cepas circulantes del virus de la hepatitis E (VHE) en humanos y reservorios animales distribuidas geográficamente por todo el mundo. La amplificación del genoma del VHE se realiza mediante RT-PCRs anidadas donde los cebadores empleados amplifican dos fragmentos de las regiones ORF1 (Open Reading Frame) y ORF2 del genoma de este virus. El diseño de los cebadores se ha basado en la creación de unos cebadores degenerados de las regiones ORF1/ORF2 del genoma del VHE. En el diseño de los cebadores se han tenido en cuenta las diferentes cepas circulantes del VHE descritas desde 1987 hasta la fecha actual, tanto en humanos como en los distintos reservorios animales detectados. Para ello se ha realizado un exhaustivo análisis de las secuencias depositadas en la base de datos de GenBank, identificando zonas conservadas en la ORF2 y zonas variables dentro de la región ORF1 que permiten una caracterización genotípica de la cepa de VHE detectada.

Por tanto, en el diseño de los cebadores se ha tenido en cuenta la gran variabilidad de cepas existentes en todo el mundo. Se han incluido cepas representantes de los 4 genotipos descritos en humanos, así como cepas de distinta procedencia geográfica para cada uno de ellos. En los virus cuyo material genético es ARN, los genomas se replican con una tasa de error varios órdenes de magnitud superior a la del ADN celular, lo que otorga a las poblaciones de estos agentes una elevada diversidad genética. Por otro lado, es importante señalar que las velocidades de evolución medidas en distintos virus de ARN están en el intervalo 10^-1 a 10^-4 sustituciones acumuladas en el ARN genómico por nucleótido y año. Esto es muy importante, ya que utilizar cebadores diseñados a partir de tan pocas secuencias, y sobre todo no actualizadas, hace muy probable que algunas de las nuevas variantes que se generan a lo largo del tiempo puedan no ser detectadas con los métodos descritos hasta hoy.

La presente invención permite por tanto, determinar la prevalencia del virus VHE en una muestra representativa de la población general, determinar el espectro clínico de la infección aguda en pacientes de entornos rurales y de zonas urbanas, evaluar el rendimiento del diagnóstico serológico y el diagnóstico molecular en la identificación de dichos casos, estudiar la presencia del VHE en granjas de ganado porcino y en muestras ambientales y obtener secuencias de todos los fragmentos y realizar estudios destinados a valorar sus relaciones filogenéticas.

Así pues, un primer aspecto de la presente invención es el uso de los cebadores directos SEQ ID NO: 1, SEO ID NO: 3, SEO ID NO: 5 y SEO ID NO: 7 y los cebadores reversos SEQ ID NO:... [Seguir leyendo]

1. Uso de los cebadores directos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7 y los cebadores reversos SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8 para detectar el virus de la hepatitis E (VHE) en una muestra biológica aislada.

2. Método para la detección del virus VHE que comprende:

a. obtener una muestra biológica y aislar sus ácidos nucleicos,

b. amplificar de forma simultánea dos fragmentos de las regiones ORF1 y ORF2 del ácido nucleico del apartado (a) por medio del par de cebadores SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2 y del par de cebadores SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 6,

c. amplificar de forma simultánea dos fragmentos internos de los fragmentos obtenidos en el apartado (b) por medio del par de cebadores SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 4 y del par de cebadores SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 8 y

d. determinar la desviación de los apartados (b) y (c) con respecto a un control.

3. Método según la reivindicación 2 donde la muestra biológica se obtiene de un mamífero.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3 donde se incluye un control interno para evaluar la presencia de inhibidores de amplificación.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 que además permite determinar el genotipo del virus VHE mediante la RT-PCR anidada de la región ORF1.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para la monitorización de la respuesta a un tratamiento de hepatitis E.

7. Kit para determinar el genotipo del VHE en una muestra biológica aislada mediante RT-PCR anidada de la región ORF1 que comprende, al menos, los cebadores SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 4.

8. Kit para la detección del virus VHE en una muestra biológica aislada mediante RT-PCR anidada que comprende, al menos, los cebadores directos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7 y los cebadores reversos SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8.

9. Kit según la reivindicación 8 para la monitorización de la respuesta a un tratamiento de hepatitis E.

10. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 que comprende, además, el control interno para evaluar la presencia de inhibidores de amplificación.