Análisis multiplexado de loci polimórficos mediante consulta simultánea y detección mediada por enzimas.

Método

(A) de determinación simultánea de la composición de nucleótidos en sitios polimórficos designados correlacionados ubicados dentro de una o más secuencias de nucleótidos diana,

comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

(a) proporcionar uno o más conjuntos de sondas, siendo capaz cada sonda de aparearse con una subsecuencia de dichas una o más secuencias de nucleótidos diana ubicadas dentro de un intervalo de proximidad a un primer sitio polimórfico designado, en el que cada sonda comprende una región de iniciación de elongación terminal capaz de aparearse con el primer sitio polimórfico designado, comprendiendo dicha región de iniciación de elongación terminal los 3-4 nucleótidos terminales del extremo 3' terminal de la sonda, y una región de anclaje dúplex, y en el que el uno o más conjuntos de sondas se inmovilizan sobre micropartículas codificadas, ensamblándose las micropartículas codificadas en un alineamiento codificado al azar;

(b) poner en contacto el conjunto de sondas con dichas una o más secuencias de nucleótidos diana para permitir la formación de complejos de hibridación colocando un sitio de consulta en la secuencia de iniciación de elongación terminal de una secuencia de sonda en alineación directa con el primer sitio polimórfico designado, en el que la región de iniciación de elongación terminal inicia una reacción de elongación catalizada por polimerasa para formar un producto de elongación si dicha secuencia de iniciación de elongación terminal coincide perfectamente con su sitio correspondiente en la secuencia de nucleótidos diana, comprendiendo dicho sitio correspondiente el primer sitio polimórfico designado, en el que la polimerasa carece de actividad exonucleasa 3' -> 5';

(c) poner en contacto el producto de elongación con una segunda sonda diseñada para hibridarse con un segundo sitio polimórfico designado;

(d) para cada complejo de hibridación, determinar la presencia del producto de elongación para indicar una coincidencia o ausencia del producto de elongación para indicar una falta de coincidencia entre el sitio de consulta y el primer sitio polimórfico designado, y para cada producto de elongación, determinar la hibridación de la segunda sonda con el segundo sitio polimórfico designado; y

(e) determinar la composición de los sitios polimórficos designados correlacionados primero y segundo, o

(B) de determinación de la composición de sitios polimórficos en un ácido nucleico diana, comprendiendo dicho método: proporcionar un ácido nucleico, teniendo dicho ácido nucleico sitios polimórficos;

elegir al menos dos sitios polimórficos como sitios designados;

proporcionar dos o más sondas capaces de consultar los sitios designados;

en el que dichas sondas comprenden una región de iniciación de elongación terminal ubicada en la posición terminal 3' de la secuencia de sonda;

consultar los sitios designados de modo que se establezca la presencia de dos o más de tales sitios designados y se determinen las composiciones en dichos dos o más sitios, en el que la etapa de consultar los sitios designados comprende formar un complejo de hibridación entre una primera sonda y dicho ácido nucleico e iniciar una elongación catalizada por polimerasa de la sonda si dicha región de iniciación de elongación terminal coincide perfectamente con la porción correspondiente de la secuencia de ácido nucleico diana en el que la polimerasa carece de actividad exonucleasa 3' -> 5';

formar un producto de elongación sometiendo a elongación dicha primera sonda; y

formar un complejo de hibridación apareando con el producto de elongación una segunda sonda diseñada para consultar un segundo sitio designado.