Matrices de micropartículas y procedimientos de preparación de las mismas.

Un procedimiento para producir biochips que comprende:

modelar un sustrato de oblea para formar una pluralidad de regiones de biochip;

trazar dicho sustrato de oblea según regiones delineadas de biochip;

ensamblar matrices de perlas que comprenden diferentes perlas ópticamente codificadas que tienenbiomoléculas unidas a las mismas, siendo dichas biomoléculas identificadas por dicha codificación óptica, en el quedicho ensamblaje se produce sobre una superficie del sustrato de oblea en dicha pluralidad de regiones de biochip; y

singular la oblea para formar una pluralidad de biochips idénticamente funcionalizados.

Matrices de micropartículas y procedimientos de preparación de las mismas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a matrices de alta densidad unitaria de micropartículas y procedimientos depreparación de las mismas. La presente invención también se refiere a matrices de múltiples chips y sus procedimientos de fabricación. La presente invención proporciona además procedimientos para realizar bioensayos usando matrices dealta densidad unitaria y matrices de múltiples chips.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Un formato de matriz para análisis biológicos y químicos sostiene la promesa de proporcionar rápidamenteresultados precisos, mientras que se minimiza el trabajo [Nature Genetics, 1999 vol. 21 (1) suplemento pág. 3-4]. Normalmente, las matrices de sondas biológicas tales como ADN, ARN o moléculas de proteína se forman tanto por deposición e inmovilización como por síntesis in situ sobre sustratos inertes. En estos procedimientos de la técnicaanterior, la formación de matrices se realiza normalmente uniendo moléculas de sondas directamente a un sustrato, quepuede estar compuesto por materiales orgánicos (tales como materiales poliméricos como nitrocelulosa) o materialesinorgánicos (tales como vidrio o silicio) .

El uso de silicio como sustrato proporciona ciertas ventajas relacionadas con los procedimientos bien establecidos de procesamiento de obleas de semiconductores y chips. En el procesamiento de semiconductores, lasobleas se modifican y transforman en una serie de múltiples etapas de procesamiento para crear rasgos deseables. Normalmente, se hace una pluralidad de rasgos idénticos sobre cada oblea simultáneamente por procesamiento enparalelo para formar segmentos individuales sobre una oblea. Se consiguen espectaculares ahorros en el tiempo defabricación fabricando rasgos idénticos usando procesamiento en paralelo o por lotes. Además, el procesamiento por lotes da alta uniformidad de chips y usando ciertos procedimientos de fotolitografía y grabado pueden fabricarse con mucha precisión rasgos muy pequeños (submicrómetros) . Por consiguiente, pueden fabricarse estructuras con altas densidades de rasgos sobre un chip muy pequeño. Después de completarse el procesamiento, los segmentos individuales se cortan de obleas en un procedimiento conocido como singulación, para obtener una multiplicidad de chips [Peter Van Zant, “Microchip Fabrication”, 3ª edición, McGraw-Hill 1998].

Las obleas de semiconductores que contienen diferentes chips funcionales pueden combinarse tanto en procedimientos de empaquetamiento finales interconectando diferentes chips o simplemente uniendo dos obleas condiferentes chips funcionales, partiendo luego la pila de obleas. La alta eficiencia del procedimiento de fabricación de semiconductores ha contribuido significativamente al rápido crecimiento de la industria. Se han desarrollado sistemasaltamente sofisticados para la producción, empaquetamiento y control de la calidad de chips.

Los biochips son matrices de diferentes biomoléculas (“sondas”) que pueden unirse a dianas específicas que están unidas a un soporte sólido. Ha habido esencialmente dos procedimientos para preparar biochips.

El primer procedimiento implica disponer alícuotas de disoluciones que contienen moléculas de sondas presintetizadas de interés sobre un sustrato plano, seguido de inmovilizar las moléculas de sondas en posiciones designadas. Por ejemplo, las disoluciones de sonda pueden dispensarse (“aplicarse en puntos”) sobre un sustrato paraformar matrices de sonda posicionalmente codificadas unidimensionales [Kricka, Larr y J., “Immunoassay”, Capítulo 18, páginas 389-404, Academic Press, 1996] o bidimensionales [patente de EE.UU. nº 5.807.755 y 5.837.551] de composición personalizada. Las sondas moleculares pueden unirse directamente a una superficie de sustrato o puedenunirse a soportes de fase sólida, que a su vez se depositan sobre o se unen a un sustrato para formar una matriz. Las micropartículas (“perlas”) representan un tipo de tal soporte. Las perlas ofrecen la ventaja de separar el procedimientode preparación y prueba de sustratos del procedimiento de preparación, aplicación y prueba de químicas de sondas y de ensayo [patente de EE.UU. nº 6.251.691]. Las perlas de diversos tamaños y composiciones se han usado extensivamente en análisis químico y bioquímico, además de en síntesis combinatoria.

Los procedimientos de deposición, impresión y aplicación por puntos para la producción de matrices de sondas tienen varias características no deseables. Primero, incluso las tecnologías de deposición e impresión del estado de latécnica sólo producen matrices de baja densidad de rasgos, reflejando dimensiones de puntos típicas de 100micrómetros y separaciones punto a punto de 300 micrómetros. Segundo, los procedimientos de deposición de sondasdescritos hasta la fecha han fracasado en producir puntos uniformes, con variaciones punto a punto significativas.Tercero, los procedimientos de aplicación por puntos, que incluyen variantes tales como deposición electroforética aelectrodos con patrón [patente de Estados Unidos nº 5.605.662] requieren soporte instrumental y logístico sustancialpara implementar la producción de matrices a cualquier escala significativa. En particular, los procedimientos deaplicación por puntos no soportan la fabricación por lotes de matrices de sondas. Es decir, aunque puede usarse unformato de procesamiento por lotes para producir eficientemente sustratos, la posterior etapa de “bio-funcionalizar” estos sustratos aplicando sondas químicas o bioquímicas es ineficaz debido a que no se ajusta a un formato por lotes, sino que en su lugar requiere muchas etapas de aplicación por puntos individuales. Por tanto, este procedimiento de fabricar grandes números de chips funcionalizados idénticos requiere mucho más tiempo y es más caro que un procedimiento que usa procedimientos de procesamiento en paralelo.

El segundo procedimiento de preparación de matrices de sondas implica síntesis fotoquímica in situ de moléculas de sondas lineales tales como oligonucleótidos y péptidos usando un procedimiento similar a fotolitografía, uncomponente convencional del procesamiento de semiconductores. Estos procedimientos se han usado más ampliamente en los últimos años para sintetizar, en un conjunto paralelo de reacciones fotoquímicas de múltiples etapas, conjuntos de oligonucleótidos en secciones de vidrio designadas de vidrio o sustratos similares [patente de Estados Unidos nº 5.143.854; Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 13555-13560]. El documento WO 01 98 765 describe el ensamblaje de biochips usando LEAPS.

Aunque el procesamiento en paralelo para generar simultáneamente una multitud de matrices de sondasdirectamente sobre una oblea tiene la ventaja de la escalabilidad y mejora intrínseca en la uniformidad proporcionadapor el procesamiento en lotes, existen graves inconvenientes para la fabricación de matrices de sondas. Primero, sólomoléculas lineales simples relativamente cortas son sintetizadas adecuadamente en una serie de reacciones de unaúnica etapa y, en la práctica, sólo las matrices de oligonucleótidos cortos han sido preparadas por este procedimiento. Segundo, las reacciones frecuentemente no avanzan hasta completitud, conduciendo a heterogeneidad composicionalsignificativa. Tercero, todo el procesamiento de semiconductores debe completarse antes de la introducción de biomoléculas, debido a que las biomoléculas pueden no ser compatibles con los duros entornos en ciertas etapas deprocesamiento de semiconductores. Esta limitación puede excluir que se tome la ventaja completa de la amplia variedadde técnicas de fabricación de semiconductores. Cuarto, si la funcionalización se realiza en un formato de fabricación porlotes, ese procedimiento de fabricación define la composición química o bioquímica (“contenido”) de cada chip sobre la oblea. Es decir, introducir un cambio en el diseño de sondas requiere que el procedimiento de fabricación entero secambie consecuentemente. La personalización, mientras que sea teóricamente factible, requiere un cambio en la secuencia de etapas de enmascarado necesarias requeridas para la síntesis fotoquímica de un conjunto deseado demoléculas de sonda. El coste y los retrasos de tiempo asociados a este procedimiento hacen que la personalización sea poco factible en la práctica.

El documento WO 01/098765 A1 enseña proporcionar diferentes conjuntos de perlas sobre un sustrato deoblea y, por tanto, conduce a biochips que están funcionalizados de forma diferente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las FIGS. 1a y 1b son una ilustración... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir biochips que comprende:

modelar un sustrato de oblea para formar una pluralidad de regiones de biochip;

trazar dicho sustrato de oblea según regiones delineadas de biochip;

ensamblar matrices de perlas que comprenden diferentes perlas ópticamente codificadas que tienen biomoléculas unidas a las mismas, siendo dichas biomoléculas identificadas por dicha codificación óptica, en el que dicho ensamblaje se produce sobre una superficie del sustrato de oblea en dicha pluralidad de regiones de biochip; y singular la oblea para formar una pluralidad de biochips idénticamente funcionalizados.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende además la etapa de cortar zanjas en dicha obleamodelada a lo largo de límites entre dichas regiones de biochip.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el corte se lleva a cabo usando productos químicos húmedos.

4. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el corte se lleva a cabo usando grabado en seco.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha matriz de perlas se protege por un recubrimientoprotector móvil antes de la singulación.

6. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende además fabricar estructuras de confinación de perlas en dichas regiones de biochip, comprendiendo las estructuras de confinación de perlas cavidades para confinar el movimiento de perlas.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que dichas cavidades se definen por fotolitografía y se forman porgrabado con iones reactivos.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que cada cavidad tiene paredes laterales rectas y una profundidad predeterminada.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dichas cavidades tienen perfiles de paredes laterales reentrantes, formándose dichos perfiles modificando las cavidades que tienen paredes laterales rectas depositando posteriormente una capa de material que se adhiere a las paredes laterales de forma que se produzcan los perfiles de paredes laterales reentrantes deseados.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicho material es dióxido de silicio.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las perlas están codificadas por color.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la codificación por colores es con colorantes fluorescentes.

13. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende además una etapa para evaluar y controlar la calidad de biochips obteniendo ópticamente imágenes de las perlas para garantizar que las cavidades formadas en dichas regiones de biochip sean sustancialmente ocupadas por perlas.

14. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende además:

seleccionar biochips que se originan a partir de una multiplicidad de sustratos de obleas; ensamblar los biochips seleccionados sobre una superficie plana para formar conjuntos de biochips reunidos; y envasar los conjuntos de biochips reunidos.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dichos conjuntos de biochips reunidos forman un dispositivo de ensayo.

16. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dichos biochips se ensamblan en un área de ensamblajedeslizando dichos biochips desde una multiplicidad de sustratos de obleas presentes sobre un sustrato común.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que dichos biochips están etiquetados para identificar el sustratode oblea de origen.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que dichos biochips se ensamblan al azar.

19. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que biochips de una multiplicidad de sustratos de obleas estánpresentes en una suspensión y, en el que dicha suspensión se deposita sobre un sustrato plano.

20. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que biochips de una multiplicidad de sustratos de oblea se recogen y se colocan sobre una superficie plana común.

21. Un procedimiento según la reivindicación 1 que comprende además disponer al menos un biochip en una región de confinamiento de líquido sobre un soporte sustrato.

22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que dicho sustrato de soporte comprende una superficie grande

hidrófila y una capa hidrófoba de modelado.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que dicha capa hidrófoba modelada sobre dicho sustrato desoporte define regiones de confinamiento de líquido.

24. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende además:

aplicar un recubrimiento movible a dicha matriz de perlas sobre un biochip, teniendo dicho recubrimiento lapropiedad de ser no reactivo con las biomoléculas sobre las superficies de las perlas.

25. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende además:

disponer una alícuota de una suspensión de perlas sobre una superficie de dicho sustrato de oblea y agitarmecánicamente la suspensión de perlas para inducir a que las perlas se sedimenten en dicha área con estructurassuperficiales para confinar perlas para formar dicha matriz de perlas.

26. El procedimiento de la reivindicación 25, en el que la etapa de agitar mecánicamente la suspensión de perlas comprende agitar dicha suspensión con un aplicador de algodón húmedo para aumentar la ocupación de perlas endicha área para confinar perlas.

27. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha región de biochip comprende:

una matriz de cavidades para confinar el movimiento de perlas sobre el sustrato;

una capa de dieléctrico modelada para modificar la impedancia de una estructura de electrolito-aislantesemiconductor cuando el sustrato está en contacto con una disolución de perlas, en el que dicha capa de dieléctricomodelada está posicionada de forma que cuando se aplique un campo eléctrico alternante, perlas en dicha disolución de perlas son accionadas para acumularse en dicha matriz de cavidades; y

una capa de pasivación protectora opcional que cubre una superficie del sustrato.

28. El procedimiento de la reivindicación 27, en el que dicha capa de dieléctrico aislante modelada define unaregión que tiene un perímetro con forma de estrella.

29. El procedimiento de la reivindicación 27, en el que dicha matriz de cavidades comprende cavidades que tienenformas seleccionadas del grupo que consiste en triángulos, pentágonos, hexágonos y círculos.

30. El procedimiento de la reivindicación 27 que comprende:

aplicar una disolución de perlas a una superficie del sustrato, comprendiendo dicha superficie dicha capa dedieléctrico modelada; y

ensamblar una matriz de perlas usando LEAPS, en el que un campo eléctrico con una primera frecuencia seaplica para inducir el movimiento de perlas hacia regiones con dieléctrico y se aplica un segundo campo eléctrico defrecuencia para disponer perlas en dicha matriz de cavidades.

31. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dichas regiones de biochip comprenden al menos una regiónde contención de perlas y, en el que dicho trazado permite romper dichas regiones de biochip para formar biochips que comprenden una o más regiones de biochip.

32. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que al menos una subpoblación de perlas está fijada a unasuperficie de al menos una región de biochip de dicho sustrato y, en el que dicha subpoblación de perlas comprendeuna biomolécula es una sonda seleccionada de una biblioteca de sondas y fijada a una pluralidad de perlas.

33. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dichas perlas se cargan y el ensamblaje comprende

depositar un primer polímero cargado sobre la superficie del sustrato de semiconductor de la oblea, teniendo dicho primer polímero cargado una carga de signo opuesto al de las perlas cargadas, depositar las perlas sobre lasuperficie del sustrato de semiconductor de la oblea,

y depositar un segundo polímero cargado sobre la superficie del sustrato de semiconductor de la oblea, teniendo dicho segundo polímero cargado una carga de signo opuesto al del primer polímero cargado.

34. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende además una etapa de obtener una pluralidad debiochips de una multiplicidad de sustratos de obleas.

35. El procedimiento de la reivindicación 34, en el que los biochips se producen rompiendo al menos un sustrato de oblea para formar dicha pluralidad de biochips.

36. El procedimiento de la reivindicación 34, en el que dichos biochips se obtienen rompiendo dos o más sustratos de obleas que comprenden diferentes poblaciones de perlas.

37. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende además:

poner en contacto un soporte de chips móvil que comprende una pluralidad de biochips preparados mediante elprocedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 unidos a un sustrato de soporte con una disolución quecomprende al menos un analito diana, dicha disolución contenida en un dispositivo funcional para contener líquido; y

detectar si los analitos diana reaccionan o no con los biochips.

38. El procedimiento de la reivindicación 37 en el que dicho soporte de chips móvil comprende al menos unacámara que contiene al menos un biochip y medios para cambiar las propiedades termodinámicas de dicha al menos una cámara.

39. El procedimiento de la reivindicación 37 que comprende múltiples etapas de procesamiento de poner en contacto dicho soporte de chips móvil con diferentes medios de reacción contenidos en una pluralidad de dispositivos funcionales.

40. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39, en el que dicho dispositivo funcional está

seleccionado del grupo que consiste en una cámara de reacción, una cámara de lavado o una etapa de lectura de 10 señales.