Un procedimiento de ligamiento de moléculas de ácido nucleico con una micropartícula que comprende:

ligar covalentemente, a una temperatura de 65ºC, seroalbúmina bovina con la superficie funcionalizada de una micropartícula hecha de un polímero, resina polimérica, vidrio o látex, y ligar covalentemente moléculas de ácido nucleico que tienen extremos 3' o 5' funcionalizados con seroalbúmina bovina en los extremos 3' o 5' funcionalizados de las moléculas de ácido nucleico.

Polielectrolito inmovilizado en superficie con múltiples grupos funcionales capaces de unirse covalentemente a biomoléculas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención está en el campo de la química de polielectrolitos.

ANTECEDENTES

Como alternativa para resolver muchos de los problemas asociados al uso diagnóstico de “matrices punteadas”de oligonucleótidos (los problemas se esbozan en “Multianalyte Molecular Analysis Using Application-Specific RandomParticle Arrays”, solicitud de EE.UU. nº de serie 10/204.799, presentada el 23 de agosto de 2002; WO 01/98765) , se forman matrices preferidas uniendo sondas oligonucleotídicas a partículas de microperlas codificadas, incluyendo partículas codificadas hechas de resina polimérica. Véase la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 10/271.602“Multiplexed Analysis of Polymorphic Loci by Concurrent Interrogation and Enzyme-Mediated Detection”, presentada el 15 de octubre de 2002, y la nº de serie 10/204.799 anterior. Se ensamblan entonces los conjugados de partícula codificada-sonda en un formato de matriz bidimensional y se ponen en contacto con muestras que se prevé quecontienen polinucleótidos diana con subsecuencias complementarias de las sondas, en que los polinucleótidos diana en las muestras se marcaron fluorescentemente antes. Se determina la unión entre las sondas y las dianas mediante lapresencia de una señal de ensayo fluorescente. Las sondas particulares que generan una señal de ensayo positivapueden determinarse decodificando la matriz.

En Hirota y col. (documento US2002/0155481) , se producen biochips planos en los que se inmovilizan sondas de ácido nucleico sobre una superficie funcionalizada. Puede añadirse seroalbúmina bovina como disolución reforzante para guiar a las sondas a los puntos de unión del chip antes del acoplamiento covalente de la sonda mediante técnicasestándares usando ácidos nucleicos modificados y superficies funcionalizadas.

En Trau y col. (documento WO02/12888) , se describen micropartículas que tienen ligado covalentemente unpolielectrolito sobre una superficie funcionalizada y unida a la misma un ácido nucleico.

Hay varios procedimientos conocidos y comercialmente disponibles para el ligamiento de sondas oligonucleotídicas con microperlas. Se ha desarrollado un gran número de esquemas de inmovilización covalente desondas oligonucleotídicas en micropartículas y están disponibles en la bibliografía pública o comercialmente. Lastécnicas de inmovilización covalente tradicionales usan perlas funcionalizadas (concretamente, perlas funcionalizadascon grupos reactivos como amino, carboxilo, tosilo, aldehído, epóxido, hidrazida y otros) para ligar con gruposfuncionales complementarios en el extremo de sondas oligonucleotídicas (Maire K. Walsh, Xinwen Wang y Bart C.Weimer, “Optimizing the immobilization of single-stranded DNA onto glass beads”, J. Biochem. Biophys. Methods 2001;

47: 221-231) . Muchas veces, dichos protocolos de unión conducen a una orientación inapropiada y a problemas deimpedimento estérico. El rendimiento de hibridación de dichas sondas inmovilizadas covalentemente puede mejorarsemediante la introducción de moléculas espaciadoras (Edwin Southern, Kalim Mir y Mikhail Shchepinov; “Molecular Interactions on Microarrays”. Nature Genetics Supplement, 21, 1999, pág. 5-9) , sin embargo, la ejecución es a menudo difícil e impracticable.

Por lo tanto, una química de unión de sonda práctica y robusta es importante para el rendimiento óptimo de unensayo basado en matriz de microperlas. La química debe permitir a las sondas unirse a las partículas con alta eficacia para mantener una concentración consistente de sondas sobre la superficie de la perla y la reacción no debe alterartampoco la eficacia de la unión sonda-diana. Además, la reacción debe tener una variabilidad mínima de lote a lote. En un procedimiento usado habitualmente, se recubren las micropartículas funcionalizadas con neutravidina (Pierce, Rockford, Ill.) , estreptavidina o avidina, que son proteínas de unión a biotina, para mediar la inmovilización de sondasbiotiniladas. La interacción de avidina-biotina es altamente específica y una de las más fuertes conocidas (con una

M-1

constante de asociación (KA) del orden de 1015 en disoluciones acuosas) y proporciona un ligamiento casiirreversible entre la proteína inmovilizada en la superficie de la perla y la molécula de sonda biotinilada. Véase lasolicitud de patente de EE.UU. nº de serie 10/271.602 anterior. El procedimiento descrito a continuación para unir sondas con polielectrolitos se prefiere a estos procedimientos conocidos porque se ha demostrado que es capaz deinducir el ligamiento de mayores números de oligonucleótidos a las perlas.

SUMARIO

La invención proporciona un procedimiento de ligamiento de moléculas de ácido nucleico con una micropartícula que comprende: ligar covalentemente, a una temperatura de 65º C, seroalbúmina bovina con la superficiefuncionalizada de una micropartícula hecha de polímero, resina polimérica, vidrio o látex y ligar covalentemente lasmoléculas de ácido nucleico que tienen extremos 3' o 5' funcionalizados con la seroalbúmina bovina en los extremos 3'

o 5' funcionalizados de las moléculas de ácido nucleico.

Se inmoviliza un polielectrolito que tiene múltiples grupos funcionales expuestos, siendo cada grupo capaz de unirse covalentemente a una biomolécula, sobre una superficie con el fin de unirse a una biomolécula. La biomoléculaes un ácido nucleico, por ejemplo, un oligonucleótido funcionalizado con amina. La BSA (seroalbúmina bovina) estáunida a una superficie funcionalizada usando una estrategia de inmovilización covalente, por ejemplo, la reacción con lasuperficie de una micropartícula activada con tosilo. Después de dicha reacción, pueden utilizarse adicionalmentegrupos funcionales reactivos expuestos en la proteína, tales como grupos amina, carboxilo, tiol o hidroxilo, para acoplar covalentemente el oligonucleótido de interés usando una química adecuada.

En una realización, los oligonucleótidos modificados en posición terminal (la posición 3' o 5' terminal) conaminas (por ejemplo, oligonucleótidos modificados con amino) se unen covalentemente a BSA usando una reacción con EDAC (1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida) (véase, por ejemplo, D. Seligal y col., Analytical Biochemistr y 218: 87091 (1994) ) . La reacción covalente da como resultado la formación de un enlace amida entre el grupo amina en elextremo del oligonucleótido y grupos carboxilo en la BSA. La reacción se ilustra en la FIG. 1.

La superficie funcionalizada es la superficie de una perla o micropartícula, que puede estar compuesta por unaserie de materiales, incluyendo polímeros, resinas poliméricas, vidrio, látex u otros que pueden funcionalizarse para la inmovilización de un polielectrolito. Se efectuaron experimentos que comparaban perlas recubiertas con BSA con seroalbúmina humana (“HSA”) , otro polielectrolito ejemplar, y también con neutravidina. Los resultados de los experimentos de hibridación indicaron que las perlas recubiertas con BSA eran capaces de ligar mayores concentraciones de oligonucleótidos con las perlas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Fig. 1 ilustra la unión de BSA a perlas funcionalizadas y la unión de una sonda oligonucleotídica a BSAusando una reacción con EDAC.

La Fig. 2 muestra las señales de hibridación de perlas oligofuncionalizadas acopladas con BSA en función de lacantidad de sonda aminada añadida para acoplamiento. Se ligó una sonda perfectamente coincidente a dos conjuntosde perlas acopladas con BSA. La BSA se acopló con el primer conjunto de perlas a 65º C y con al segundo a 37º C. Se observó una eficacia de hibridación mucho mayor (mayor señal) en el primer conjunto de perlas con las que se acopló laBSA a 65º C. Un tercer conjunto de perlas acopladas con BSA a 65º C y funcionalizadas con una sonda de control negativa no coincidente muestra una hibridación despreciable, indicando por tanto que la señal potenciada no es el resultado de una unión no específica aumentada.

La Fig. 3 muestra los resultados de valoración de perlas acopladas con BSA. Como en la Fig. 2, la eficacia dela hibridación es mayor para las perlas acopladas con BSA a mayor temperatura que a menor temperatura, como se demuestra por la diferencia en la señal de hibridación de una diana puesta en contacto con una sonda... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de ligamiento de moléculas de ácido nucleico con una micropartícula que comprende:

ligar covalentemente, a una temperatura de 65º C, seroalbúmina bovina con la superficie funcionalizada de unamicropartícula hecha de un polímero, resina polimérica, vidrio o látex, y ligar covalentemente moléculas de ácido5 nucleico que tienen extremos 3' o 5' funcionalizados con seroalbúmina bovina en los extremos 3' o 5' funcionalizados de las moléculas de ácido nucleico.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las moléculas de ácido nucleico se unen a la seroalbúminabovina a través de un enlace amida, formado por una reacción con 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la superficie de la micropartícula está funcionalizada con10 grupos funcionales tosilo.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las moléculas de ácido nucleico seligan a la seroalbúmina bovina a través de los grupos carboxilo o amino de la seroalbúmina bovina.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la molécula de ácido nucleico es unoligonucleótido.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el oligonucleótido se funcionaliza en su extremo 3' o 5' con un grupo amino primario.