POLIELECTROLITO INMOVILIZADO EN SUPERFICIE CON MÚLTIPLES GRUPOS FUNCIONALES CAPACES DE UNIRSE COVALENTEMENTE A BIOMOLÉCULAS.

Un procedimiento de ligamiento de moléculas de ácido nucleico con una micropartícula que comprende:

ligar covalentemente, a una temperatura de 65ºC, seroalbúmina bovina con la superficie funcionalizada de una micropartícula hecha de un polímero, resina polimérica, vidrio o látex, y ligar covalentemente moléculas de ácido nucleico que tienen extremos 3' o 5' funcionalizados con seroalbúmina bovina en los extremos 3' o 5' funcionalizados de las moléculas de ácido nucleico.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2004/031058.

Solicitante: BIOARRAY SOLUTIONS LTD.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 35 TECHNOLOGY DRIVE WARREN, NJ 07059 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: BANERJEE, SUKANTA, WANG,Xinwen.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • B05D3/00 SECCION B — TECNICAS INDUSTRIALES DIVERSAS; TRANSPORTES.B05 PULVERIZACION O ATOMIZACION EN GENERAL; APLICACION DE LIQUIDOS U OTRAS MATERIAS FLUIDAS A SUPERFICIES, EN GENERAL.B05D PROCEDIMIENTOS PARA APLICAR LIQUIDOS U OTRAS MATERIAS FLUIDAS A SUPERFICIES, EN GENERAL (transporte de objetos en los baños de líquidos B65G, p. ej.. B65G 49/02). › Tratamiento previo de superficies sobre las que los líquidos u otros materiales fluidos van a ser aplicados; Tratamiento ulterior de los revestimientos aplicados, p. ej. tratamiento intermedio de un revestimiento ya aplicado, para preparar las aplicaciones ulteriores de líquidos u otros materiales fluidos.
  • B23B9/04 B […] › B23 MAQUINAS-HERRAMIENTAS; TRABAJO DE METALES NO PREVISTO EN OTRO LUGAR.B23B TORNEADO; TALADRADO (usando un electrodo en lugar de una herramienta B23H, p.ej. haciendo agujeros B23H 9/14; trabajando con un haz de laser B23K 26/00; dispositivos para copiar o controlar B23Q). › B23B 9/00 Máquinas de tornear automáticas o semiautomáticas dotadas de varios husillos de trabajo, p. ej. máquinas automáticas multihusillos en las que los husillos se encuentran dispuestos susceptible de ser colocados en posiciones determinadas; Equipo para estas máquinas (equipo aplicable a las máquinas de un solo husillo B23B 7/00). › con husillos de trabajo horizontales.
  • C07H21/04 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con desoxirribosilo como radical sacárido.
  • C12M1/34 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12M EQUIPOS PARA ENZIMOLOGIA O MICROBIOLOGIA (instalaciones para la fermentación de estiércoles A01C 3/02; conservación de partes vivas de cuerpos humanos o animales A01N 1/02; aparatos de cervecería C12C; equipos para la fermentación del vino C12G; aparatos para preparar el vinagre C12J 1/10). › C12M 1/00 Equipos para enzimología o microbiología. › Medida o ensayo de detección de las condiciones del medio, p. ej. por contadores de colonias.
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • G01N33/53 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
  • G01N33/543 G01N 33/00 […] › con un soporte insoluble para la inmovilización de compuestos inmunoquímicos.

PDF original: ES-2375962_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Polielectrolito inmovilizado en superficie con múltiples grupos funcionales capaces de unirse covalentemente a biomoléculas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención está en el campo de la química de polielectrolitos.

ANTECEDENTES

Como alternativa para resolver muchos de los problemas asociados al uso diagnóstico de “matrices punteadas”de oligonucleótidos (los problemas se esbozan en “Multianalyte Molecular Analysis Using Application-Specific RandomParticle Arrays”, solicitud de EE.UU. nº de serie 10/204.799, presentada el 23 de agosto de 2002; WO 01/98765) , se forman matrices preferidas uniendo sondas oligonucleotídicas a partículas de microperlas codificadas, incluyendo partículas codificadas hechas de resina polimérica. Véase la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 10/271.602“Multiplexed Analysis of Polymorphic Loci by Concurrent Interrogation and Enzyme-Mediated Detection”, presentada el 15 de octubre de 2002, y la nº de serie 10/204.799 anterior. Se ensamblan entonces los conjugados de partícula codificada-sonda en un formato de matriz bidimensional y se ponen en contacto con muestras que se prevé quecontienen polinucleótidos diana con subsecuencias complementarias de las sondas, en que los polinucleótidos diana en las muestras se marcaron fluorescentemente antes. Se determina la unión entre las sondas y las dianas mediante lapresencia de una señal de ensayo fluorescente. Las sondas particulares que generan una señal de ensayo positivapueden determinarse decodificando la matriz.

En Hirota y col. (documento US2002/0155481) , se producen biochips planos en los que se inmovilizan sondas de ácido nucleico sobre una superficie funcionalizada. Puede añadirse seroalbúmina bovina como disolución reforzante para guiar a las sondas a los puntos de unión del chip antes del acoplamiento covalente de la sonda mediante técnicasestándares usando ácidos nucleicos modificados y superficies funcionalizadas.

En Trau y col. (documento WO02/12888) , se describen micropartículas que tienen ligado covalentemente unpolielectrolito sobre una superficie funcionalizada y unida a la misma un ácido nucleico.

Hay varios procedimientos conocidos y comercialmente disponibles para el ligamiento de sondas oligonucleotídicas con microperlas. Se ha desarrollado un gran número de esquemas de inmovilización covalente desondas oligonucleotídicas en micropartículas y están disponibles en la bibliografía pública o comercialmente. Lastécnicas de inmovilización covalente tradicionales usan perlas funcionalizadas (concretamente, perlas funcionalizadascon grupos reactivos como amino, carboxilo, tosilo, aldehído, epóxido, hidrazida y otros) para ligar con gruposfuncionales complementarios en el extremo de sondas oligonucleotídicas (Maire K. Walsh, Xinwen Wang y Bart C.Weimer, “Optimizing the immobilization of single-stranded DNA onto glass beads”, J. Biochem. Biophys. Methods 2001;

47: 221-231) . Muchas veces, dichos protocolos de unión conducen a una orientación inapropiada y a problemas deimpedimento estérico. El rendimiento de hibridación de dichas sondas inmovilizadas covalentemente puede mejorarsemediante la introducción de moléculas espaciadoras (Edwin Southern, Kalim Mir y Mikhail Shchepinov; “Molecular Interactions on Microarrays”. Nature Genetics Supplement, 21, 1999, pág. 5-9) , sin embargo, la ejecución es a menudo difícil e impracticable.

Por lo tanto, una química de unión de sonda práctica y robusta es importante para el rendimiento óptimo de unensayo basado en matriz de microperlas. La química debe permitir a las sondas unirse a las partículas con alta eficacia para mantener una concentración consistente de sondas sobre la superficie de la perla y la reacción no debe alterartampoco la eficacia de la unión sonda-diana. Además, la reacción debe tener una variabilidad mínima de lote a lote. En un procedimiento usado habitualmente, se recubren las micropartículas funcionalizadas con neutravidina (Pierce, Rockford, Ill.) , estreptavidina o avidina, que son proteínas de unión a biotina, para mediar la inmovilización de sondasbiotiniladas. La interacción de avidina-biotina es altamente específica y una de las más fuertes conocidas (con una

M-1

constante de asociación (KA) del orden de 1015 en disoluciones acuosas) y proporciona un ligamiento casiirreversible entre la proteína inmovilizada en la superficie de la perla y la molécula de sonda biotinilada. Véase lasolicitud de patente de EE.UU. nº de serie 10/271.602 anterior. El procedimiento descrito a continuación para unir sondas con polielectrolitos se prefiere a estos procedimientos conocidos porque se ha demostrado que es capaz deinducir el ligamiento de mayores números de oligonucleótidos a las perlas.

SUMARIO

La invención proporciona un procedimiento de ligamiento de moléculas de ácido nucleico con una micropartícula que comprende: ligar covalentemente, a una temperatura de 65º C, seroalbúmina bovina con la superficiefuncionalizada de una micropartícula hecha de polímero, resina polimérica, vidrio o látex y ligar covalentemente lasmoléculas de ácido nucleico que tienen extremos 3' o 5' funcionalizados con la seroalbúmina bovina en los extremos 3'

o 5' funcionalizados de las moléculas de ácido nucleico.

Se inmoviliza un polielectrolito que tiene múltiples grupos funcionales expuestos, siendo cada grupo capaz de unirse covalentemente a una biomolécula, sobre una superficie con el fin de unirse a una biomolécula. La biomoléculaes un ácido nucleico, por ejemplo, un oligonucleótido funcionalizado con amina. La BSA (seroalbúmina bovina) estáunida a una superficie funcionalizada usando una estrategia de inmovilización covalente, por ejemplo, la reacción con lasuperficie de una micropartícula activada con tosilo. Después de dicha reacción, pueden utilizarse adicionalmentegrupos funcionales reactivos expuestos en la proteína, tales como grupos amina, carboxilo, tiol o hidroxilo, para acoplar covalentemente el oligonucleótido de interés usando una química adecuada.

En una realización, los oligonucleótidos modificados en posición terminal (la posición 3' o 5' terminal) conaminas (por ejemplo, oligonucleótidos modificados con amino) se unen covalentemente a BSA usando una reacción con EDAC (1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida) (véase, por ejemplo, D. Seligal y col., Analytical Biochemistr y 218: 87091 (1994) ) . La reacción covalente da como resultado la formación de un enlace amida entre el grupo amina en elextremo del oligonucleótido y grupos carboxilo en la BSA. La reacción se ilustra en la FIG. 1.

La superficie funcionalizada es la superficie de una perla o micropartícula, que puede estar compuesta por unaserie de materiales, incluyendo polímeros, resinas poliméricas, vidrio, látex u otros que pueden funcionalizarse para la inmovilización de un polielectrolito. Se efectuaron experimentos que comparaban perlas recubiertas con BSA con seroalbúmina humana (“HSA”) , otro polielectrolito ejemplar, y también con neutravidina. Los resultados de los experimentos de hibridación indicaron que las perlas recubiertas con BSA eran capaces de ligar mayores concentraciones de oligonucleótidos con las perlas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Fig. 1 ilustra la unión de BSA a perlas funcionalizadas y la unión de una sonda oligonucleotídica a BSAusando una reacción con EDAC.

La Fig. 2 muestra las señales de hibridación de perlas oligofuncionalizadas acopladas con BSA en función de lacantidad de sonda aminada añadida para acoplamiento. Se ligó una sonda perfectamente coincidente a dos conjuntosde perlas acopladas con BSA. La BSA se acopló con el primer conjunto de perlas a 65º C y con al segundo a 37º C. Se observó una eficacia de hibridación mucho mayor (mayor señal) en el primer conjunto de perlas con las que se acopló laBSA a 65º C. Un tercer conjunto de perlas acopladas con BSA a 65º C y funcionalizadas con una sonda de control negativa no coincidente muestra una hibridación despreciable, indicando por tanto que la señal potenciada no es el resultado de una unión no específica aumentada.

La Fig. 3 muestra los resultados de valoración de perlas acopladas con BSA. Como en la Fig. 2, la eficacia dela hibridación es mayor para las perlas acopladas con BSA a mayor temperatura que a menor temperatura, como se demuestra por la diferencia en la señal de hibridación de una diana puesta en contacto con una sonda oligonucleotídicaunida a perlas... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento de ligamiento de moléculas de ácido nucleico con una micropartícula que comprende:

ligar covalentemente, a una temperatura de 65º C, seroalbúmina bovina con la superficie funcionalizada de unamicropartícula hecha de un polímero, resina polimérica, vidrio o látex, y ligar covalentemente moléculas de ácido5 nucleico que tienen extremos 3' o 5' funcionalizados con seroalbúmina bovina en los extremos 3' o 5' funcionalizados de las moléculas de ácido nucleico.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las moléculas de ácido nucleico se unen a la seroalbúminabovina a través de un enlace amida, formado por una reacción con 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la superficie de la micropartícula está funcionalizada con10 grupos funcionales tosilo.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las moléculas de ácido nucleico seligan a la seroalbúmina bovina a través de los grupos carboxilo o amino de la seroalbúmina bovina.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la molécula de ácido nucleico es unoligonucleótido.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el oligonucleótido se funcionaliza en su extremo 3' o 5' con un grupo amino primario.


 

Patentes similares o relacionadas:

Dispositivo de ensayo y método para realizar ensayos biológicos, del 27 de Marzo de 2019, de MyCartis N.V: Un dispositivo de ensayo que comprende una cámara de reacción y al menos dos conjuntos de microportadores codificados individualmente en donde los al menos dos […]

Procedimiento para la detección delimitada por espacios de reacción de uno o varios analitos en una muestra, del 27 de Marzo de 2019, de ATTOMOL GMBH MOLEKULARE DIAGNOSTIKA: Procedimiento para la detección de analitos en una muestra, que comprende las etapas: a) aplicar una muestra y una solución de reacción sobre un soporte, siendo […]

Técnica de imagen nanoplasmónica para el mapeo espacio-temporal de las secreciones de células únicas en tiempo real, del 26 de Marzo de 2019, de The Government of the United States of America, as represented by the Secretary of the Navy: Un método para el mapeo espacio-temporal de secreciones de proteínas de células vivas individuales en tiempo real, que comprende: generación de imágenes […]

Dispositivo y procedimiento de identificación y de determinación de grupos sanguíneos, del 12 de Marzo de 2019, de DIAGAST: Dispositivo para la identificación y la determinación de grupos sanguíneos a partir de una muestra de sangre entera, caracterizado por que comprende un […]

Reactivo y procedimiento de análisis inmunológico, del 5 de Marzo de 2019, de LSI Medience Corporation: Un reactivo para análisis inmunológico, que comprende una suspensión de partículas de látex que tienen un antígeno o un anticuerpo específico para una sustancia […]

Método y dispositivo para bioensayos, del 28 de Febrero de 2019, de Abionic SA: Biosensor para detectar y cuantificar biomoléculas marcadas de manera fluorescente, comprendiendo dicho biosensor : […]

Particulas programadas de espectroscopia intensificada por superficie, del 27 de Febrero de 2019, de SICPA HOLDING SA: Una partícula programable de SES que comprende: una superficie activa a espectroscopía intensificada por superficie (SES); y un informador […]

Amplificación de la señal en inmunoensayos, del 27 de Febrero de 2019, de Abaxis, Inc: Un procedimiento de detección de la presencia de un anticuerpo en una muestra de ensayo que comprende: (a) poner en contacto la muestra de ensayo con un primer detector […]

Otras patentes de BIOARRAY SOLUTIONS LTD

 

Otras patentes de la CIP G01N33/543