Determinación de la abundancia de mensajes y el número de copias de alelos usando TIV con constructos cebador-promotor-selector monocatenarios.

Constructo cebador-promotor-selector monocatenario para detectar la presencia o la cantidad relativa de una subsecuencia diana en una muestra,

que comprende tres subsecuencias que incluyen:

una subsecuencia de cebador complementaria a dicha subsecuencia diana, que tiene su extremo 5' adyacente al extremo 3' de una subsecuencia de promotor, pudiendo dicha subsecuencia de promotor dirigir la transcripción de una subsecuencia de selector única, que tiene su extremo 3' adyacente al extremo 5' de la subsecuencia de promotor.

Determinación de la abundancia de mensajes y el número de copias de alelos usando TIV con constructos cebador- promotor-selector monocatenarios

Antecedentes

La amplificación lineal de ARNm o ADN genómico usando transcripción in vitro, o TIV, es un método bien conocido de la biología molecular (véase Krieg & Melton, 1984, Melton, 1984). Debido a que TIV, para cada diana, produce un número de productos de ARN que es proporcional al número original de copias de esa diana, permite la determinación de la abundancia relativa de mensajes (patentes estadounidenses n.°s 5.545.522; 5.716.785; y 5.891.636; Van Gelder et al, 199) y por tanto se ha aplicado ampliamente en el contexto del análisis de la expresión génica (patente estadounidense n.° 5.514.545). TIV también es un elemento central en determinados métodos isotérmicos de amplificación exponencial de dianas que pueden detectar ARN o ARNm patógeno a bajos niveles (patente estadounidense n.° 5.399.491; patente europea n.° 368 96 B2; Guatelli et al., 199).

Según la técnica anterior, tal como se da a conocer en las patentes estadounidenses n.°s 6.291.17 y 5.514.545, así como en las solicitudes de patente estadounidense 25/13194 y 25/123943, la secuencia convencional de la etapa es la siguiente: se realiza la síntesis de ADNc, de la manera más frecuente usando un cebador complementario al extremo 3 de poliA de ARN que incluye una secuencia de promotor de T7 (hebra que no es molde) en su extremo 5; alternativamente, pueden colocarse cebadores específicos de secuencia o de gen en posiciones distintas del extremo 5. Tras la digestión con ARNasaH del molde de ARN o desnaturalización por calor de híbrido de ARN-ADN, se realiza la síntesis de ADN de segunda hebra (Goubler, U., 1983), para producir ADNbc de longitud completa o parcial (dependiendo de la colocación de los cebadores), que incorpora una secuencia de promotor de T7 bicatenaria (y regiones adyacentes). En realizaciones prácticas del método, debe añadirse ADN polimerasa o RT a la reacción para catalizar eficazmente la síntesis de segunda hebra (véase la patente estadounidense n.° 5.545.522, que describe el uso de ADN polimerasa de E. col¡\ Kwoh et al., 1989). Se sintetiza ARN antisentido (ARNa) a partir de la segunda hebra de ADN mediante transcripción in vitro, y se detectan los productos de ARNa, por ejemplo mediante hibridación para capturar sondas de oligonucleótidos, incluyendo variantes tales como balizas moleculares (Vet, J.A.M., 22; véase también la solicitud de patente con n.° de serie 11/218838 de BioArray Solutions; presentada el 2/9/25, a continuación) o el ensayo de protección de hibridación (véase la patente estadounidense n.° 6.4.745; Arnold et al.) o elongación de sondas. Todos estos métodos de la técnica requieren la síntesis de ADNc bicatenario a partir de las dianas de ARNm originales, y la etapa intermedia de degradación de ARN. Las etapas complejas y que requieren mucho tiempo de estos métodos los han restringido efectivamente a la investigación en laboratorio. En un entorno clínico, el uso de tales protocolos complejos requeriría una formación especial, y a menudo certificación, de personal técnico en laboratorios cualificados para llevar a cabo tal análisis complejo (esotérico).

Detección y análisis de secuencia de ácidos nucleicos - también puede aplicarse TIV al análisis de ADN, incluyendo análisis de mutaciones o polimorfismos. Generalmente, estas aplicaciones requieren una amplificación exponencial de material genético, es decir, ADN genómico, de la manera más común mediante la aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa (Syvanen, A.C., 25, véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 4.683.22; Mullís) o amplificación de genoma completo, en una multiplicidad de variantes (véase, por ejemplo patentes del USCD sobre la amplificación de genoma completo mediada por ligamiento, patente estadounidense n.° 5,686,243). TIV ofrece un método de selección de hebra tras amplificación por PCR (véase, por ejemplo, la solicitud de BioArray Solutions presentada el 2/9/25; n.° de serie 11/218838; presentada (TIV)) que, entre otros, tiene la ventaja de permitir la combinación de esa etapa con la detección multiplexada posterior de hebras de ARN producidas en la reacción de TIV.

Será útil simplificar y acelerar el diseño de reacciones de detección y amplificación multiplexada fiables, y sustituir los procedimientos complejos para el análisis de la expresión génica (patente estadounidense n.° 5.514.545) y otras tareas de análisis de ácidos nucleicos mediante protocolos más sencillos, más robustos adecuados para el entorno clínico. Especialmente en ese contexto, también será útil desarrollar protocolos integrados, es decir, protocolos que combinan múltiples etapas de análisis, preferiblemente de manera que permita la realización de formatos de ensayo homogéneos. Será especialmente útil, para reducir el tiempo requerido para completar el ensayo, y particularmente el tiempo invertido, para combinar la amplificación y el análisis, mediante la detección de múltiples productos de amplificación. Además, la combinación de etapas, preferiblemente de manera compatible con la realización de formatos de ensayo homogéneos, facilitará la miniaturización, lo que reducirá a su vez el consumo de reactivos así como el riesgo de contaminación, tanto de muestras como de instalaciones de laboratorio.

Una reacción de TIV, y en particular, una reacción de TIV que usa un molde monocatenario (en vez de un molde bicatenario), tal como se describe en el presente documento, ofrece muchas de estas ventajas.

De hecho, la capacidad de la ARN polimerasa de T7 para utilizar la hebra molde del promotor en forma monocatenaria y catalizar la transcripción a partir de un molde monocatenario (mmc) que produce una copia de la hebra de ADN original de interés, se ha descrito en la bibliografía (Kukarin, A. et al, 23; Korencic D. et al, 22;

Temiakov D. et al, 22). Sin embargo, en implementaciones prácticas de TIV (convencionales), esta reacción se ha considerado un efecto secundario adverso de la transcripción in vitro.

La reacción de mmc-TIV, hasta la fecha, no se ha aplicado completamente al desarrollo y la realización de protocolos analíticos complejos, principalmente debido a determinadas características generalmente no deseadas. En primer lugar, su moderado rendimiento, en comparación con el formato de TIV regular que usa moldes de ADN bicatenario (be), limita la sensibilidad de protocolos de ensayo realizados en configuraciones convencionales que requieren un número sustancial de moléculas diana; y su escaso rendimiento en tampones incluso de fuerza iónica moderada generalmente hace que sea incompatible con otras reacciones enzimáticas posteriores y anteriores empleadas en protocolos de ensayo existentes. Sin embargo, abordando estos puntos tal como se describe a continuación, puede optimizarse la mmc-TIV para hacer que sea adecuada para numerosas aplicaciones de análisis de ácidos nucleicos, de manera que permite la integración de amplificación y detección simultánea y análisis de múltiples productos.

Bibliografía de antecedentes

Puede hacerse referencia a lo siguiente como antecedentes para ayudar a comprender determinados términos y expresiones a continuación. Se hace referencia a esta bibliografía a veces en el texto a continuación mediante el autor, número u otra designación.

Seo, M.Y., Rha, S. Y., Yang S.H., Kim, S.C., Lee, G.Y., Park, C.H., Chung, H.C. et al. 24. The pattern of gene copy number changes in bilateral breast cáncer surveyed by cDNA microarray-based comparative genomic hybridization. Int. J. of Mol Med 13: 17-24

Sellers, W. R. 25. Nature, número del 7 de julio

Hirsch F.R. et al. 25. J Nati Cáncer Inst 97:621-623,643-655.

Ogino S, Wilson RB., 24. piñal muscular atrophy: molecular genetics and diagnostics. Expert Rev Mol Diagn. enero de 24; 4(1 ):15-29.

Dutta S, Nandagopal K, Gangopadhyay PK, Mukhopadhyay K., 25. Molecular aspeets of down syndrome. Indian Pediatr. abril de 25; 42(4):339-44.

Gubler, U., y Hoffman, B. (1983) Gene 25, 263-269

Vet, Jacqueline A.M., Van der Rijt J. M., y Blom Henk J. 22. Molecu beacons: colorful analysis of nucleic acids. Expert Rev. Mol. Diagn 2(1)

Kukarin A., Rong M, McAllister WT. 23. Exposure of T7 RNA polymerase to the isolated binding región of the promoter allows transcription from a single-stranded témplate. J Biol Chem. 278(4):2419-24

Korencic D, Solí D, Ambrogelly A. 22. A one-step method for in-vitro production of tRNA transcripts. Nucleic Acids Res. 3(2):e15

Temiakov D, Anikin M, McAllister WT. 22. Characterization of T7 RNA polymerase... [Seguir leyendo]

Constructo cebador-promotor-selector monocatenario para detectar la presencia o la cantidad relativa de una subsecuencia diana en una muestra, que comprende tres subsecuencias que incluyen:

una subsecuencia de cebador complementaria a dicha subsecuencia diana, que tiene su extremo 5 adyacente al extremo 3 de una subsecuencia de promotor, pudiendo dicha subsecuencia de promotor dirigir la transcripción de una subsecuencia de selector única, que tiene su extremo 3 adyacente al extremo 5 de la subsecuencia de promotor.

Constructo según la reivindicación 1, en el que el promotor no dirige la transcripción de la subsecuencia de cebador.

Constructo según la reivindicación 1, en el que el promotor es una subsecuencia de promotor de T7 o T3 o SP6.

Kit que comprende una pluralidad de diferentes tipos de constructos cebador-promotor-selector monocatenarios cada uno para detectar la presencia o cantidad relativa de una subsecuencia diana diferente en una muestra, comprendiendo cada uno tres subsecuencias que incluyen:

una subsecuencia de cebador complementaria a dicha subsecuencia diana, que tiene su extremo 5 adyacente al extremo 3 de una subsecuencia de promotor, pudiendo dicha subsecuencia de promotor dirigir la transcripción de una subsecuencia de selector única, que tiene su extremo 3 adyacente al extremo 5 de la subsecuencia de promotor; y

un conjunto de oligonucleótidos, en el que oligonucleótidos con diferentes secuencias se presentan en micropartículas codificadas de diferente manera, y en el que los oligonucleótidos pueden hibridarse al producto de transcripción de la subsecuencia de selector.

Kit según la reivindicación 4, en el que los diferentes tipos de constructos difieren en su subsecuencia de cebador y subsecuencias de selector respectivas.

Kit según la reivindicación 4, que incluye además NTP marcados que pueden incorporarse en el producto de transcripción.

Kit según la reivindicación 6, en el que los NTP se marcan ópticamente.

Kit según la reivindicación 4, en el que el promotor es una subsecuencia de promotor de T7 o T3 o SP6 (hebra molde).

Kit según la reivindicación 8, que incluye además una subsecuencia de promotor de T7, T3 o SP6 que no es molde que puede formar un dúplex con dicha subsecuencia de promotor de T7, T3 o SP6.

Kit según la reivindicación 4, que incluye además un conjunto de micropartículas codificadas de diferente manera adaptadas para unir diferentes tipos de oligonucleótidos a las mismas que son complementarios a los productos de transcripción.

Kit según la reivindicación 4, que incluye además un conjunto de ddNTP o dNTP marcados diseñados para la incorporación en un producto de extensión cuando se extiende la subsecuencia de cebador.

Kit según la reivindicación 4, que incluye además ddNTP o dNTP marcados con hapteno.

Kit según la reivindicación 12, que incluye además partículas magnéticas.

Kit según la reivindicación 4, que incluye además un oligonucleótido que puede hibridarse a una subsecuencia en la muestra que está ubicada en el lado 3 de una subsecuencia de selección como diana de cebador o en el cebador.

Kit según la reivindicación 14, en el que el oligonucleótido se marca.

Kit según la reivindicación 14, en el que el oligonucleótido incluye la subsecuencia de promotor.

Método de determinación de la abundancia relativa de subsecuencias designadas en una muestra, que comprende:

(i) asociar de manera única al menos una subsecuencia diana designada representada como cebador a al

18.

19.

2.

21.

22.

23.

24.

26.

27.

28.

29.

3. 55

31.

32.

33.

34. 65

menos una secuencia de selector en las que ambas forman parte de un constructo cebador-promotor- selector monocatenario, que comprende tres subsecuencias:

una subsecuencia de cebador complementaria a dicha subsecuencia diana, que tiene su extremo 5 adyacente al extremo 3 de una subsecuencia de promotor, pudiendo dicha subsecuencia de promotor dirigir la transcripción de una subsecuencia de selector única, que tiene su extremo 3 adyacente al extremo 5 de la subsecuencia de promotor;

(ii) amplificar la subsecuencia de selector; y

(iii) detectar la cantidad relativa de producto de amplificación.

Método según la reivindicación 17, en el que la subsecuencia de cebador y las subsecuencias diana no se amplifican.

Método según la reivindicación 17, en el que la amplificación de la subsecuencia de selector es mediante transcripción in vitro (TIV) y el producto de amplificación es un ARN que comprende la secuencia complementarla a la secuencia de selector.

Método según la reivindicación 17, en el que la secuencia designada es: ARN incluyendo ARNm y ARN viral, ADN genómico o un producto de PCR.

Método según la reivindicación 2, en el que las secuencias diana designadas están presentes en una forma que puede hibridarse con la subsecuencia de cebador.

Método según la reivindicación 2, en el que las secuencias diana designadas son los alelos de un gen particular.

Método según la reivindicación 2, en el que la etapa de asociar de manera única comprende hibridar las partes de cebador de los constructos cebador-promotor-selector a dichas subsecuencias dianas designadas.

Método según la reivindicación 23, que incluye además la etapa de separar los constructos que se han hibridado a dichas subsecuencias designadas de los que no se han hibridado a una subsecuencia designada.

Método según la reivindicación 23, que incluye además la etapa de extender las partes de cebador de los constructos cebador-promotor-selector.

Método según la reivindicación 25, en el que los constructos que incluyen cebadores extendidos se separan de los que no se han extendido.

Método según la reivindicación 24, en el que la separación de los constructos no hibridados y no extendidos y dNTP o ddNTP marcados no usados, u oligonucleótidos, se realiza mediante separaciones en columna de afinidad o exclusión molecular, separación en fase sólida incluyendo separación magnética, tratamientos enzlmátlcos o combinaciones de cualquiera de estos.

Método según la reivindicación 25, en el que la extensión se realiza mediante extensión mediada por molde o ligamiento mediado por molde.

Método según la reivindicación 28, en el que la extensión incorpora dNTP, ddNTP marcados u oligonucleótidos marcados.

Método según la reivindicación 2, en el que los constructos extendidos se capturan en una fase sólida.

Método según la reivindicación 3, en el que la fase sólida es partículas magnéticas.

Método según la reivindicación 28, en el que la extensión y el ligamiento son específicos de alelo.

Método según la reivindicación 17, en el que la etapa de detectar la cantidad relativa de producto de

amplificación es mediante elongación de sondas catalizada por RT presentadas en micropartículas codificadas, y en el que el producto de amplificación sirve como molde para la elongación.

Método según la reivindicación 33, en el que la detección se realiza simultáneamente a la amplificación.

Método según la reivindicación 34, en el que la amplificación y la detección de la amplificación del producto

36. 5

37.

38.

39.

41.

42.

simultáneas se producen en un volumen de reacción de 1 ni o menos.

Método según la reivindicación 19, en el que la reacción de TIV introduce una firma óptica detectable en el producto de ARN.

Método según la reivindicación 17, en el que una parte que no es molde de un promotor de T7 o T3 o SP6 se añade antes de la amplificación.

Método según la reivindicación 19, en el que la etapa de detectar la cantidad relativa de producto de amplificación es mediante hibridación del producto de amplificación para capturar sondas presentadas en micropartículas codificadas.

Método de determinación de la pérdida de heterocigosidad en una muestra genómica usando un par de constructos cebador-promotor-selector monocatenarios específicos de alelo, que comprenden cada uno tres subsecuencias:

una subsecuencia de cebador única complementaria a una subsecuencia diana, que tiene su extremo 5 adyacente al extremo 3 de una subsecuencia de promotor, pudiendo dicha subsecuencia de promotor dirigir la transcripción de una subsecuencia de selector única, que tiene su extremo 3 adyacente al extremo 5 de la subsecuencia de promotor;

comprendiendo el método:

asociar de manera única una primera secuencia de selector única con el alelo normal del gen de interés y una segunda secuencia de selector única con el alelo variante de ese gen; amplificar las secuencias de selector; y

determinar intensidades de señal que indican la abundancia relativa de los alelos amplificados;

Y

determinar si existe una pérdida de heterocigosidad.

Método según la reivindicación 17, usado para el análisis de la expresión génica, el recuento de alelos o la determinación del número de copias alélicas.

Método de determinación de la cantidad relativa de una subsecuencia designada presente en una muestra de ARNm con el fin del análisis de la expresión génica, que comprende:

a) proporcionar una muestra de ARNm que incluye dicha subsecuencia designada;

b) proporcionar un constructo monocatenario que incluye, desde el extremo 3 hasta el 5, una subsecuencia de cebador complementaria a al menos una parte de dicha subsecuencia designada, una subsecuencia de promotor de la transcripción y una subsecuencia de selector única, y en el que el promotor de la transcripción está orientado de modo que, en las condiciones apropiadas, dirige la transcripción de la subsecuencia de selector;

c) proporcionar condiciones para la hibridación de la subsecuencia de cebador y el ARNm, y para la extensión de la subsecuencia de cebador;

d) retirar los constructos que no se hibridan con ARNm;

e) transcribir la secuencia de selector;

f) determinar la cantidad de ARN generada por la transcripción; y

g) correlacionar dicha cantidad de ARN frente a una cantidad de ARN producida con las mismas etapas de reacción a) a f) pero con una subsecuencia designada diferente y selector diferente, para indicar la cantidad relativa de ARNm que incluye dicha subsecuencia designada y la cantidad relativa de dicha subsecuencia designada en dicha muestra.

Método según la reivindicación 41, en el que el ARNm se aísla de una célula o se genera a partir de ADN genómico, a partir de un producto de PCR o a partir de la amplificación.

Método según la reivindicación 41, en el que el constructo cebador-promotor-selector para transcripción inversa incluye una subsecuencia de promotor de T7 o T3 o SP6.

transcripción está orientado de modo que, en las condiciones apropiadas, dirige la transcripción de la subsecuencia de selector;

62.

63.

64.

c) proporcionar condiciones para la extensión de la subsecuencia de cebador en el sentido de 3 para generar un constructo elongado con nucleótidos complementarios a los de las regiones alineadas del ARN o ADN, siempre que el nucleótido designado en el cebador sea complementario al nucleótido en dicho sitio, y en el que la subsecuencia elongada adquiere un hapteno de afinidad durante el proceso de elongación;

e) separar el constructo elongado del exceso de constructo no usado mediante la unión del hapteno de afinidad a ligandos presentados en la superficie de un soporte sólido;

f) transcribir las secuencias de selector de los constructos elongados unidos a los soportes sólidos, o transcribir las secuencias de selector del constructo elongado o no unido a los soportes sólidos, para generar ARN; y

g) determinar la presencia de ARN generado, que indica que el nucleótido designado en la subsecuencia de cebador es complementario al sitio polimórfico o de mutación de interés.

Método según la reivindicación 61, en el que el hapteno de afinidad es biotina o un resto antigénico y el ligando es estreptavidina o neutravidina o un anticuerpo.

Método según la reivindicación 61, en el que los soportes sólidos son magnéticos o paramagnéticos, y tras la unión de marcadores a los soportes sólidos, los soportes sólidos se ven atraídos magnéticamente para fijar su ubicación, y luego se retiran los constructos no usados.

Método según la reivindicación 61, en el que el soporte sólido está en forma de una columna de afinidad o la separación incluye separación en columna.

Método según la reivindicación 61, en el que el ARNm se retira o se mantiene en su lugar tras la extensión del constructo.

66. Método según la reivindicación 65, en el que la retirada es mediante digestión catalizada por ARNasaH.

67. Método según la reivindicación 44, en el que la separación en columna está precedida por tratamiento con exonucleasa 1.

68. Método según la reivindicación 44, en el que el ARN generado se captura mediante hibridación con oligonucleótidos presentados en micropartículas codificadas, en el que micropartículas codificadas de diferente manera presentan diferentes oligonucleótidos.

69. Método según la reivindicación 44, en el que tras la captura los oligonucleótidos se elongan en una reacción que incluye dNTP marcados o ddNTP marcados para producir productos de elongación marcados.

7. Método según la reivindicación 44, en el que ARN se marca mediante la incorporación de NTP marcados.

71. Método según reivindicaciones 69 ó 7, en el que las señales de micropartículas que se sabe que presentan oligonucleótidos específicos identifican la presencia de un polimorfismo o una mutación.

72. Método según la reivindicación 44, en el que, para cada sitio polimórfico/de mutación de interés, se proporciona un par de constructos, en el que un miembro del par, que comprende una primera subsecuencia de selector, tiene, en su extremo 3, un nucleótido tal que el cebador es complementario al alelo normal, y el segundo miembro del par, que comprende una segundo subsecuencia de selector, tiene, en su extremo 3, un nucleótido tal que el cebador es complementario a un alelo variante.

73. Método de determinación de la presencia de sitios polimórficos o de mutación en una muestra de ADN o ARN, que comprende:

a) proporcionar una muestra de ARN o ADN que incluye dichos sitios polimórficos o de mutación;

b) proporcionar, para cada uno de dichos sitios de interés, uno de los siguientes que tiene un nucleótido que, cuando se alinea y se híbrida con el ARN o ADN; es complementario al nucleótido en el sitio de Interés y en el que el otro de los siguientes tiene su nucleótido terminal respectivo, en 5 o 3, respectivamente, alineado con un nucleótido que es inmediatamente adyacente al nucleótido en el sitio de Interés; un primer oligonucleótido, complementarlo en su totalidad o en parte a una subsecuencia en el ARN o ADN, que puede marcarse o puede tener un marcador asociado con el mismo; un constructo monocatenarlo que incluye, desde el extremo 3 hasta el 5: una subsecuencia de cebador complementarla a al menos una

parte de una subsecuencia designada, una subsecuencia de promotor de la transcripción, y una subsecuencia de selector única, y en el que el promotor de la transcripción está orientado de modo que, en las condiciones apropiadas, dirige la transcripción de la subsecuencia de selector;

c) proporcionar condiciones para el ligamiento del primer oligonucleótido y el constructo para generar un producto ligado;

d) proporcionar las condiciones para la retirada del constructo en exceso;

e) transcribir las secuencias de selector del producto ligado unido o no unido a los soportes sólidos para generar ARN o ARN marcado cuando se usan NTP marcados para la síntesis de ARN; y

f) determinar la presencia de ARN generado, que, si está presente, indica que o bien el nucleótido alineado en el primer oligonucleótido o bien en el constructo, según sea apropiado, es complementario al nucleótido en el sitio de interés.

Método según la reivindicación 73, que incluye además la etapa de extender la primera parte o la primera parte del producto ligado con dNTP marcados, en el que el marcador proporciona un sitio al que puede unirse un ligando; y separar el producto ligado del ARNm mediante la unión del/de los marcador(es) a ligandos presentados en la superficie de un soporte sólido.

Método según la reivindicación 73, en el que la primera parte está marcada o no marcada.

Método según la reivindicación 73, usado para detectar la presencia de ARNm de un virus en una muestra, usando un alineamiento de perlas coensambladas con perlas de captura magnéticas que portan oligonucleótidos que se hibridan con ARNm de interés, y perlas de detección codificadas que portan oligonucleótidos para caracterizar el ARN que resulta de la reacción en las etapas a) a e).

Método según las reivindicaciones 61 ó 73, usado para determinar si un sujeto es homocigoto, heteroclgoto o normal para un loci de mutación y/o polimórfico en un ensayo multiplexado, determinado los números relativos de, y las razones de ARN normales con respecto a variantes generados en el ensayo.

Métodos según las reivindicaciones 61 ó 73, usados para determinar la pérdida de heterocigosidad en un sujeto.