Procesamiento de imágenes y análisis de datos matriciales.

Procedimiento de hallazgo de una cuadrícula a partir de una imagen fluorescente de una matriz de fuentes deseñal,

que comprende:

hallar los centros de fuente de la señal;

construir líneas que conectan las fuentes de señal vecinas en hexágonos;

dividir líneas hexagonales;

hallar un ángulo de orientación de la matriz;

hallar los límites de las filas de la matriz;

hallar los límites de las columnas de la matriz;

transformar la matriz completa en una alineación con el marco de la imagen, es decir, ángulo de orientación cero;hallar líneas de la cuadrícula de filas en la matriz transformada, y

hallar líneas de la cuadrícula de columnas de la matriz transformada;

caracterizado porque:

si las filas de la matriz son verticales, recogiendo todas las coordenadas X de centros de fuente de señaltransformados en un conjunto de posiciones de fila;

si las filas de la matriz son horizontales, recogiendo todas las coordenadas de centros de fuente de señaltransformados en el conjunto de las posiciones de fila;

dividir el conjunto de posiciones de fila en grupos, donde los grupos adyacentes están dentro de una primeradistancia umbral;

calcular y clasificar grupos con el fin de agrupar las medias;

eliminar grupos donde la distancia a un grupo vecino está dentro de una segunda distancia umbral;

determinar si las diferencias entre los grupos exceden la primera distancia umbral, y, si es así, insertar un númeroapropiado de grupos, de manera que los grupos estén dentro de la primera distancia umbral entre sí;

determinar las respectivas posiciones relativas de las filas basándose en la media de los elementos de perlas en lasfilas respectivas;

generar un conjunto de líneas de la cuadrícula de tal manera que las líneas de cuadrícula en el conjunto estén amedio camino entre filas adyacentes; y

añadir una línea superior, paralela a las líneas de la cuadrícula y adyacente a la primera fila de la matriz, y añadiruna línea inferior, paralela a las líneas de la cuadrícula y adyacente a la última fila de la matriz, estando dichaslíneas superior e inferior a una distancia a partir de la línea de cuadrícula respectiva más cercana, que es la mismaque la distancia entre líneas de cuadícula adyacentes.

Procesamiento de imágenes y análisis de datos matriciales

Antecedentes Los recientes avances rápidos en la biología molecular han creado más demanda de pruebas de alto volumen basadas en la necesidad de cribar bibliotecas cada vez más grandes de compuestos, validar el creciente número de marcadores genéticos y comprobar las poblaciones de pacientes cada vez más diversificadas. Esto ha llevado al desarrollo de nuevos formatos de matriz, en particular para el análisis de la interacción de ácido nucleico y proteínaproteína, que permiten el procesamiento en paralelo mediante la realización de ensayos necesarios en un formato "multiplexado".

Convencionalmente, estas determinaciones se realizan mediante la producción de matrices de ácidos nucleicos y anticuerpos por medio de "manchado" o "impresión" de soluciones alícuotas en papel de filtro, papel secante u otros sustratos. Sin embargo, a pesar de su uso actual generalizado en la investigación académica para el análisis de la expresión génica y perfiles de proteínas, las matrices producidas por manchado tienen deficiencias, especialmente en aplicaciones que colocan altas exigencias en la precisión y fiabilidad y llamando para el análisis de un gran volumen de muestras con alto rendimiento. En otra técnica desarrollada más recientemente, matrices de sondas espacialmente codificadas se producen a modo de síntesis de oligonucleótidos fotoquímica in-situ. Sin embargo, esta tecnología se limita en la práctica a la producción de sondas cortas de oligonucleótidos - como resultado, se requieren tecnologías alternativas para la producción de matrices de ADNc y proteína. Además, la síntesis in situ impide la personalización de la matriz de sondas rápida, dado el tiempo y el costo de la remodelación necesarios para el proceso de síntesis fotoquímica.

Además de estas dificultades inherentes relacionadas con el rendimiento del ensayo, las matrices espacialmente codificadas producidas por procedimientos convencionales de manchado o síntesis in-situ generalmente requieren instrumentos especializados de escaneado óptico para extraer datos de calidad utilizable. Los sistemas comerciales disponibles para este fin se basan en el escaneo láser confocal - un proceso lento - incluso a la resolución espacial típicamente modesta de ~ 5 μm - que se debe repetir para cada señal de color.

Con el fin de resolver muchos de los problemas asociados con los usos de diagnóstico y análisis de las "matrices manchadas" de oligonucleótidos y proteínas (como se indica en "Análisis molecular multianalito utilizando matrices de partículas al azar específicas de la aplicación", solicitud US No. 10/204, 799, publicada el 23/8/2002; WO 01/98765) , las matrices de oligonucleótidos o matrices de proteínas se pueden formar mediante la visualización de estas fracciones de captura en micropartículas codificadas químicamente ("cuentas") que luego son ensambladas en matrices planas compuestas de tales portadores funcionalizados codificados. Ver la solicitud de patente US No. 10/271, 602 "Análisis multiplexado de loci polimórficos de interrogación concurrente y detección mediada por enzimas", presentada el 15/10/2002 y nº de serie 10/204, 799 supra.

Las matrices de micropartículas que exhiben oligonucleótidos o proteínas de interés pueden ser montadas por montaje electrocinético controlado por luz (véase, por ejemplo, las patentes US 6.468.811; 6.514.771; 6.251.691) o por un procedimiento de montaje de disposición directa (descrito anteriormente en "Matrices de micropartículas y Procedimientos de preparación de las mismas", presentada el 9/7/02; No. No. 10/192.352) .

Para realizar el análisis de ácido nucleico o proteína, tales matrices portadoras codificadas se ponen en contacto con muestras anticipadas que contienen polinucleótidos diana o ligandos de proteínas de interés. La captura de la diana o ligando a agentes de captura particulares mostrados en los portadores del tipo correspondiente según lo identificado mediante un código de color produce una firma óptica, tal como una señal de fluorescencia, ya sea directamente o indirectamente por medio de decoración posterior, de acuerdo con uno de varios procedimientos conocidos. La identidad de agentes de captura, incluyendo sondas o receptores de la proteína (referidos en este documento algunas veces también colectivamente como "receptores") generar una señal de ensayo positivo se puede determinar por los portadores de decodificación dentro de la matriz. Véase la solicitud de patente US "Análisis molecular multianalito utilizando matrices de partículas al azar específicas de la aplicación" número 10/204.799.

Estas matrices de micropartículas ("cuentas") contienen generalmente un número de tipos de cuentas espectralmente distinguibles dentro de un área lo suficientemente pequeña como para ser vista por un microscopio óptico estándar. La pequeña huella y el alto contraste de la señal permiten la imagen multicolor "instantánea" directa ("snapshot") de toda la matriz bajo un microscopio, eliminando así la necesidad de escaneo láser confocal.

El análisis de las imágenes grabadas a partir de dichas matrices de cuentas codificadas aleatorias implica varias etapas y problemas, tal como se describe en la solicitud de patente US "Análisis, acceso seguro a, y transmisión de imágenes de la matriz" número 10/714.203. Para identificar los receptores individuales de puntuación positiva (y negativa) en un ensayo dado, la imagen del ensayo que comprende un patrón de intensidades de señal grabadas a partir de cuentas individuales dentro de la matriz se compara con una imagen de decodificación, tomada antes (o después) del ensayo. Como se describe en detalle en el documento US Nº 10/714.203, este proceso se realiza de forma automatizada mediante la construcción de un mapa que comprende grupos de decodificación ("grupos") de cuentas del mismo tipo (que muestra el mismo tipo de receptor) . Un procedimiento rápido para construir el mapa de decodificación (también referido como el "mapa de grupo") se describe en la presente memoria que invoca una plantilla adaptable.

Además, Galinksy et al. Bioinformátics 19 (14) : 1832-1836 (2003) describe imágenes de tasa de expresión de punto bajo, que son imágenes en las que no todas las cuentas son fluorescentes. En tales situaciones, Galinsky sugiere el uso de una plantilla de cuadrícula, donde la cuadrícula se pre-construye/conoce a priori y encaja simplemente. Además, Galinsky enseña que el algoritmo utilizado para indexar los puntos organizados en cuadrículas hexagonales a partir de la formación de imágenes de los haces de micromatrices de fibra óptica requiere información relacionada con la estructura geométrica de la cuadrícula hexagonal, tal como el número de capas de fibra de núcleo individual en cada minihaz y el número de capas de minihaces en el haz de micromatriz.

La determinación de las intensidades de las cuentas individuales en la imagen del ensayo permite la cuantificación de los resultados, por ejemplo, en la expresión del gen o el análisis de biomarcadores de proteína. Para determinar las intensidades de señal de la cuenta, la imagen se divide en segmentos mediante la construcción de una cuadrícula de manera que cada campo en la cuadrícula contiene como máximo una cuenta - a continuación se registran las intensidades de las intensidades de campo de cuadrícula. Debido a que la etapa para hallar la cuadrícula se realiza en una imagen que está alineada dentro del campo de visión, una primera etapa de procesamiento es la de la rotación de la imagen.

Aunque la etapa para hallar la cuadrícula se puede realizar en una imagen de campo brillante (como se describe en el documento US Nº 10/714.203) , es ventajoso eliminar la grabación de una imagen de campo brillante buscando en su lugar la cuadrícula directamente para decodificar y ensayar imágenes, que comprende típicamente imágenes de fluorescencia. Además, la imagen de fluorescencia típicamente tiene un contraste considerablemente mayor, es decir, la relación de la señal con el fondo. Sin embargo, varios problemas se deben superar. En primer lugar, las cuentas que muestran receptores que no producen una señal de ensayo no serán visibles en la imagen de fluorescencia, y esto conducirá generalmente a la corrupción de los bordes de la cuadrícula, lo que afecta la etapa de rotación de la imagen que se basa en la determinación precisa de la orientación de la imagen original mediante la medición de la orientación de los bordes. En segundo lugar, los fuentes de señal tales como cuentas fluorescentes pueden ser desplazados al azar del centro de cada campo de cuadrícula, un hecho que puede afectar a la intensidad registrada a partir... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de hallazgo de una cuadrícula a partir de una imagen fluorescente de una matriz de fuentes de señal, que comprende: hallar los centros de fuente de la señal; construir líneas que conectan las fuentes de señal vecinas en hexágonos; dividir líneas hexagonales; hallar un ángulo de orientación de la matriz; hallar los límites de las filas de la matriz; hallar los límites de las columnas de la matriz; transformar la matriz completa en una alineación con el marco de la imagen, es decir, ángulo de orientación cero; hallar líneas de la cuadrícula de filas en la matriz transformada, y hallar líneas de la cuadrícula de columnas de la matriz transformada;

caracterizado porque: si las filas de la matriz son verticales, recogiendo todas las coordenadas X de centros de fuente de señal transformados en un conjunto de posiciones de fila;

si las filas de la matriz son horizontales, recogiendo todas las coordenadas de centros de fuente de señal

transformados en el conjunto de las posiciones de fila; dividir el conjunto de posiciones de fila en grupos, donde los grupos adyacentes están dentro de una primera distancia umbral;

calcular y clasificar grupos con el fin de agrupar las medias; eliminar grupos donde la distancia a un grupo vecino está dentro de una segunda distancia umbral; determinar si las diferencias entre los grupos exceden la primera distancia umbral, y, si es así, insertar un número

apropiado de grupos, de manera que los grupos estén dentro de la primera distancia umbral entre sí;

determinar las respectivas posiciones relativas de las filas basándose en la media de los elementos de perlas en las filas respectivas; generar un conjunto de líneas de la cuadrícula de tal manera que las líneas de cuadrícula en el conjunto estén a

medio camino entre filas adyacentes; y añadir una línea superior, paralela a las líneas de la cuadrícula y adyacente a la primera fila de la matriz, y añadir una línea inferior, paralela a las líneas de la cuadrícula y adyacente a la última fila de la matriz, estando dichas líneas superior e inferior a una distancia a partir de la línea de cuadrícula respectiva más cercana, que es la misma que la distancia entre líneas de cuadícula adyacentes.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, que también incluye separar fuentes de señal transformados en dos grupos, donde uno de los grupos contiene fuentes de señal de filas numeradas impares, mientras que el otro grupo contiene fuentes de señal de filas numeradas pares.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, que también incluye hallar dos conjuntos de líneas de la cuadrícula de columnas mediante la separación de las fuentes de señales transformadas en dos conjuntos, donde un conjunto contiene fuentes de señal de filas numeradas impares y el otro juego contiene fuentes de señal de las columnas numeradas pares.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las fuentes de señal individuales son perlas fluorescentes.