Análisis multiplexado de ácidos nucleicos mediante fragmentación de ADN bicatenario.

Método para detectar secuencias de nucleótidos particulares en una muestra de oligonucleótidos bicatenarios,

que consiste esencialmente en las siguientes etapas:

a. amplificar segmentos de la muestra e incorporar marcadores en los amplicones durante la amplificación para generar amplicones bicatenarios marcados;

b. escindir los amplicones bicatenarios usando ácido clorhídrico durante minutos para despurinizar las bases, seguido por la adición de hidróxido de sodio y desnaturalización térmica, en ubicaciones que no están alineadas entre las hebras de amplicón, para generar fragmentos sentido y antisentido que no son totalmente complementarios seguido por congelación rápida de los fragmentos;

c. mezclar los fragmentos con un tampón de hibridación;

d. poner los fragmentos en contacto con un conjunto de oligonucleótidos monocatenarios en condiciones de apareamiento, en el que los oligonucleótidos monocatenarios en el conjunto son complementarios a los fragmentos o a subsecuencias de los fragmentos y

e. detectar la hibridación entre dicho conjunto de oligonucleótidos monocatenarios y los fragmentos.

Análisis multiplexado de ácidos nucleicos mediante fragmentación de ADN bicatenario Antecedentes

En un protocolo de ensayo de hibridación mediante transferencia puntual inversa multiplexado convencional usado en el procedimiento de detección de la presencia de alelos particulares en una muestra, en primer lugar se amplifican loci seleccionados en el ADN genómico bicatenario usando pares de cebadores directos e inversos y se retira una hebra designada de cada uno de los amplicones bicatenarios, por ejemplo mediante digestión enzimática o separación magnética. Sólo las hebras restantes, preferiblemente marcadas, se ponen en contacto con un par de sondas relacionadas, aplicadas o puestas de otro modo sobre un sustrato, tal como una tira de nitrocelulosa, o presentadas en micropartículas codificadas en una preparación para un ensayo de hibridación. La hibridación se detecta normalmente basándose en la presencia de un marcador asociado con el conjunto de dianas capturadas o con las sondas correspondientes. La decodificación permite la determinación de las subsecuencias de las hebras capturadas por sondas particulares, indicando que las sondas de captura son complementarias a tales subsecuencias.

La retirada de las hebras designadas pretende mejorar la eficacia de captura de las hebras restantes en las sondas, eliminando el reapareamiento hebra-hebra, un proceso que compite con el apareamiento con las sondas de captura relacionadas, y que tendría lugar si no sin la selección y la retirada de hebra en el protocolo.

Las hebras pueden retirarse mediante digestión, en la que las hebras seleccionadas para la retirada se fosforilan en primer lugar y se digieren luego enzimáticamente usando una enzima de digestión tal como 7,-endonucleasa para las hebras fosforiladas. Las hebras también pueden retirarse mediante separación magnética. Tanto la digestión como la separación magnética añaden costes y mano de obra al protocolo de ensayo. Una alternativa preferida sería generar fragmentos monocatenarios a partir de amplicones, eliminando de ese modo la necesidad de digestión o separación magnética.

Se conocen varios métodos para generar fragmentos monocatenarios de longitud aleatoria a partir de ADN bicatenario. En el método de secuenciación de Maxam y Gilbert convencional (A. Maxam and W. Gilbert, PNAS 74, pág. 56, 1977), se generan fragmentos de ADN bicatenario mediante la degradación química selectiva de múltiples copias de las especies de ADN que van a secuenciarse. Se ajustan las condiciones para producir fragmentos de todas las longitudes posibles; es decir, pueden separarse fragmentos en fracciones que difieren entre sí en longitud en una única base. Cuando se ordenan, la secuencia de fracciones con sus bases terminales respectivas representa la secuencia de la especie de ADN original.

E. Southern et al. también han generado fragmentos monocatenarios de tamaño aleatorio a partir de ADN bicatenario para facilitar la transferencia del ADN desde geles de agarosa para su transferencia sobre membranas para un análisis adicional mediante hibridación con sondas de oligonucleótidos, lo que representa un formato de transferencia puntual. Se ajustan las condiciones para producir fragmentos que lo son suficientemente cortos como para minimizar el enmarañado dentro del gel.

Hasta la fecha, nadie ha sugerido el uso de fragmentos de amplicones sin digestión o separación de hebras para su uso en formatos de ensayo de hibridación mediante transferencia puntual inversa. Por tanto, no hay ninguna sugerencia de que, para análisis multiplexado de polimorfismos (MAP), sea preferible el uso de una mezcla compleja de fragmentos dianas altamente heterogéneos al uso de una única secuencia diana, o como máximo unas pocas secuencias diana. Además, para usar la fragmentación para MAP, a menos que se ajusten las condiciones correctamente, pueden eliminarse algunos o todos los sitios polimórficos, o puede ser poco práctico el mareaje, y no se han sugerido ninguno de estos problemas ni sus soluciones.

Proudnikov et al., Analytical Biochemistry 259, 34-41 (1998) se refiere a la inmovilización del ADN en gel de poliacrilamida para la fabricación de microchips de ADN y oligonucleótidos de ADN. A este respecto, se despurinó ADN amplificado por PCR durante 3-6 min en ácido fórmico al 8%, seguido por modificación con amino en los sitios despurinizados con o sin fragmentación del ADN, para la inmovilización sobre una micromatriz de gel.

Lhomme et al., Biopolymers 52, 65-83 (1999) comentan la generación de sitios apurínicos en condiciones ácidas y la posterior fragmentación en condiciones alcalinas.

Un método convencional de mareaje de amplicones es realizar la amplificación con cebadores marcados en el extremo terminal 5 para producir amplicones marcados en los extremos. Este método de mareaje de extremos requiere que las hebras marcadas permanezcan intactas porque, después de la fragmentación, únicamente se marcará una pequeña parte de los fragmentos que contienen el extremo terminal 5. Por tanto, se necesita un método de mareaje diferente en el que no se fragmenten los amplicones.

Sumario

La presente invención proporciona un método para detectar secuencias de nucleótidos particulares en una muestra de oligonucleótidos bicatenarios, que consiste esencialmente en las siguientes etapas:

a. amplificar segmentos de la muestra e incorporar marcadores en los amplicones durante la amplificación para generar amplicones bicatenarios marcados;

b. escindir los amplicones bicatenarios usando ácido clorhídrico durante 15 minutos para despurinizar las bases, seguido por la adición de hidróxido de sodio y desnaturalización térmica, en ubicaciones que no están alineadas entre las hebras de amplicón, para generar fragmentos sentido y antisentido que no son totalmente complementarios seguido por la congelación rápida de los fragmentos;

c. mezclar los fragmentos con un tampón de hibridación;

d. poner los fragmentos en contacto con un conjunto de oligonucleótidos monocatenarios en condiciones de apareamiento, en el que los oligonucleótidos monocatenarios del conjunto son complementarios a los fragmentos o a subsecuencias de los fragmentos y

e. detectar la hibridación entre dicho conjunto de oligonucleótidos monocatenarios y los fragmentos.

Se definen realizaciones adicionales de la invención en las reivindicaciones.

Se da a conocer un método de fragmentación de ADN bicatenario para su uso en el análisis de ácidos nucleicos, notablemente en el análisis multiplexado de polimorfismos y mutaciones. El método produce una multiplicidad de fragmentos sentido y antisentido marcados que no son complementarios, y por tanto no se reaparean significativamente en condiciones adecuadas para el análisis de hibridación (o análisis de elongación mediada por captura) de los polimorfismos y/o las mutaciones. Los fragmentos presentan una distribución de longitud deseada o predicha. Pueden seleccionarse sitios de escisión de tal manera que los fragmentos sean cortos, aunque lo suficientemente largos como para permitir la discriminación entre fragmentos en un ensayo, y por probabilidad estadística, de tal manera que la mayoría de los fragmentos contengan al menos un nucleótido marcado para facilitar la detección. Es decir, se ajustan las condiciones para producir una distribución de longitud de fragmento que genera una densidad lineal seleccionada de mareaje de hebras, mediante la inclusión de nucleótidos marcados. En una realización alternativa, la mayoría de fragmentos son comparables en longitud con la longitud de las sondas de captura relacionadas.

Se transforma ADN bicatenario (o amplicones bicatenarios derivados de ADN bicatenario mediante amplificación) en un conjunto de fragmentos sentido y antisentido mediante escisión de hebras en una multiplicidad de sitios que están distribuidos aleatoriamente a lo largo de cada hebra para producir fragmentos que no son totalmente complementarios. Esto puede lograrse simplemente mediante escisión en la misma base en cada hebra. Estos fragmentos luego se ponen en contacto, en condiciones de apareamiento, con sondas que son totalmente complementarias a al menos algunos de los fragmentos predichos. Se detectan acontecimientos de hibridación, y basándose en los resultados, se determina la presencia o ausencia de segmentos de oligonucleótidos particulares en la muestra.

Las ventajas de este método son:

(i) eliminar la etapa de selección de hebra tras PCR;

(ii) potenciar la eficacia de captura de diana seleccionando la densidad de sitios de fragmentación para generar dianas relativamente cortas que tienen una estructura secundaria mínima y presentan una alta afinidad... [Seguir leyendo]

Método según la reivindicación 15, en el que la comparación se realiza automáticamente usando un programa de software.