Método de tipado de ácido nucleico para seleccionar donantes registrados para determinar la compatibilidad cruzada con receptores de transfusión.

Método de selección de un donante de transfusión mediante la determinación de la compatibilidad con un receptor comparando combinaciones de marcadores polimórficos en un conjunto de tales marcadores,

de donantes candidatos y un receptor en el que dicha determinación se realiza tras someter material genómico/ADN de donantes candidatos y el receptor a amplificación para generar de ese modo productos amplificados, en el que los productos amplificados se someten a un ensayo de hibridación o a un ensayo de elongación mediado por captura o a ambos, en el que se genera una señal de ensayo por los eventos de hibridación o elongación individuales, según sea aplicable, mediante pares de sondas en las que los miembros del par son complementarios, en su totalidad o en parte, a las subsecuencias de los productos amplificados que son los mismos que y/o que son complementarios a los marcadores polimórficos en el conjunto;

en el que se genera un patrón de intensidad de señal de ensayo a partir de eventos de hibridación o elongación, de modo que cada marcador en el conjunto está representado por un par de intensidades de señal de ensayo particulares, comprendiendo el método: determinar el patrón de intensidad de señal de ensayo generado a partir de dicho ensayo de hibridación o elongación y formar, para cada par de sondas, una combinación de intensidades de señal asociadas con los miembros del par;

generar a partir de dichas combinaciones de intensidades de señal una serie de valores, cada valor en la serie seleccionado de uno de tres posibles valores, que indican respectivamente un estado homocigótico normal, heterocigótico u homocigótico variante para formar de ese modo un patrón de reacción;

determinar las combinaciones de marcadores polimórficos representadas por dichos patrones de reacción; y

seleccionar de los donantes candidatos un donante que tiene dicha combinación de marcadores polimórficos idéntica a la del receptor, en el que la combinación de intensidades de señal de miembros se representa de modo que una intensidad de este tipo, iN, se correlaciona con la cantidad de marcador normal en la muestra, y la otra intensidad de este tipo, iV, se correlaciona con la cantidad de marcador variante en la muestra, y dichas intensidades se combinan para formar un parámetro de discriminación Δ ≥ (iN-iV)/(iN+iV) que varía entre -1 y 1.

Método de tipado de ácido nucleico para seleccionar donantes registrados para determinar la compatibilidad cruzada con receptores de transfusión Antecedentes La identificación de anticuerpos y la provisión de sangre negativa para antígenos forma la base para una transfusión sanguínea segura minimizando el riesgo de reacciones transfusionales adversas, desencadenadas cuando los anticuerpos que circulan en el torrente sanguíneo del paciente se encuentran con los antígenos presentados en los eritrocitos de un donante. La práctica actual en la medicina transfusional prevé el tipado serológico y el marcado de toda la sangre del donante para los antígenos ABO y RHD para facilitar la compatibilidad de los componentes de glóbulos rojos con el grupo sanguíneo del receptor. La reducción adicional de la aloinmunización sigue siendo un problema clínico importante, y por tanto sería sumamente deseable ser compatible con antígenos de grupos sanguíneos adicionales. Sin embargo, esta práctica queda descartada por la ausencia de antisueros apropiados y la complejidad de protocolos de tipado serológico que requieren mucha mano de obra, particularmente cuando se encuentran múltiples aloanticuerpos. Como resultado, la mayoría de los centros de donantes sólo seleccionan cohortes seleccionadas de donantes y mantienen un inventario limitado de unidades negativas para antígenos. Esta práctica puede introducir retrasos en el tratamiento y por tanto crear un gasto adicional significativo en el cuidado de los pacientes, y también puede agravar las situaciones de urgencia.

El tipado de ADN de donante exhaustivo de donantes, tal como se describió recientemente (véase Reid et al., Transfusion, mayo de 2005) permitirá a los centros de donantes mantener un registro de posibles donantes, e inventarios grandes y diversos de productos sanguíneos completamente caracterizados disponibles para su envío instantáneo. Además, el análisis de genes de grupo sanguíneo a nivel de ADN proporciona una idea detallada de la diversidad alélica subyacente a la variabilidad fenotípica, un enfoque que ayuda a abordar problemas clínicos que no pueden abordarse mediante técnicas serológicas, tales como determinación de tipos de antígeno para los que los anticuerpos disponibles apenas son reactivos, el análisis de pacientes que han recibido recientemente una transfusión, o la identificación de fetos que corren el riesgo de sufrir enfermedad hemolítica del recién nacido. Aunque el genotipo puede no reflejar el fenotipo, un análisis de ADN identificará el que es potencialmente negativo para antígenos que, si se desea, puede confirmarse mediante hemaglutinación clásica. El tipado de ADN exhaustivo también puede extenderse a receptores y de hecho puede aplicarse a toda la población recurriendo a metodologías prácticas, preferiblemente eMAP™, realizada en una plataforma BeadChip™ (véase el documento US2004/0002073 A1)

Compatibilidad cruzada genética Una compatibilidad, o casi compatibilidad, entre marcadores seleccionados identificados en un receptor, y en donantes candidatos de sangre transfundida (correspondiendo los marcadores a sitios polimórficos ubicados en genes que codifican para antígenos de grupo sanguíneo e incluyendo específicamente antígenos de grupo sanguíneo minoritario) minimizará generalmente el riesgo de inmunización del receptor y, en receptores inmunizados, el riesgo de reacciones inmunitarias adversas mediadas por aloanticuerpos tras transfusión. Es decir, si se selecciona el conjunto de marcadores para determinar mediante sonda los alelos relevantes asociados con reacciones hemolíticas a transfusión clínicamente significativas (“alorreacciones”) , entonces una comparación de marcadores de receptor y donante permitirá la selección de donantes que son genéticamente compatibles con un receptor dado. Por ejemplo, cada uno de un conjunto de gemelos monocigóticos, genéticamente idénticos, sería el donante ideal para el otro. En el caso de transfusión, el requisito de identidad genética (o casi identidad) de receptor y donante candidato se limita a un conjunto de genes relevantes que, cuando se expresan, codifican para determinados antígenos eritrocitarios humanos (HEA) presentados en células portadas por la sangre frente a los que el receptor o bien ya ha producido (en base a una exposición anterior) anticuerpos (“aloanticuerpos”) o puede producir anticuerpos. Por tanto, los marcadores que se correlacionan con antígenos eritrocitarios humanos (HEA) incluyen los antígenos “mayores” (A, B y Rh) así como varios antígenos “menores” clínicamente relevantes (por ejemplo, Duffy, Kell, Kidd, MNS, Dombrock y otros) .

El beneficio de un procedimiento de compatibilidad cruzada genética de este tipo será minimizar o reducir no sólo el riesgo de reacciones inmunitarias adversas, sino también el riesgo de inmunizar receptores en primer lugar, eliminar la necesidad de y permitir la rápida selección de productos sanguíneos para transfusión de un grupo de donantes registrados y completamente caracterizados, denominado también en el presente documento registro de donantes. Una vez completamente implementada, implementada de manera genética, la compatibilidad cruzada genética eliminará el cuello de botella limitante creado por el coste creciente de los reactivos serológicos y los protocolos complejos y que requieren mucha mano de obra así como la necesidad de repetir pruebas.

Sumario Se dan a conocer un método y un algoritmo para la compatibilidad cruzada genética basándose en la comparación de genotipos de receptor y donante (y las combinaciones subyacentes de alelos y haplotipos) . Preferiblemente, tal

como se ha descrito, en una solicitud en tramitación junto con la presente, titulada “Multiplexed Analysis of Polymorphic Loci by Concurrent Interrogation and Enzyme-Mediated Detection”, presentada el 10/15/2002, documento US 2004/0002073 A1, los genotipos se determinan en una única prueba (“multiplexada”) para permitir un tipado rápido y a gran escala. El método de la invención, en vez de centrarse en la predicción del fenotipo tal como se recomienda en los procedimientos convencionales, se basa en su lugar en una comparación de variantes genéticas identificadas en el receptor y los donantes disponibles, cuya información se compilará preferiblemente en un registro de donantes ampliamente disponible, para maximizar la compatibilidad molecular. El uso, por ejemplo, de un formato BeadChip™ tal como se da a conocer en el presente documento, para permitir, a un coste razonable, el genotipado exhaustivo a gran escala de antígenos de transfusión clínicamente relevantes, realizado preferiblemente en un contexto de examen neonatal, permitiría que el genotipo de antígeno de transfusión (“TAG”) (e información genética relacionada) pasara a formar parte de informes médicos individuales que podrían almacenarse en un formato fácilmente accesible tal como chips implantables, u otras etiquetas electrónicas portadas, por ejemplo, en pulseras.

Breve descripción de las figuras Las figuras 1A y 1B ilustran el uso de múltiples sondas codificadas para resolver la ambigüedad a través de determinación de fase.

Descripción detallada Para los presentes propósitos, se define un genotipo como una sucesión de marcadores en sitios polimórficos seleccionados (también denominados en el presente documento alelos) ; es decir, valores que proporcionan la configuración de marcadores de ácido nucleico diana ubicados dentro de uno o más genes de interés. Preferiblemente, cada sitio designado se estudia con un par de sondas de elongación de las que una está diseñada para detectar el alelo normal (N) , la otra para detectar un alelo variante (V) específico, en condiciones que garantizan que se produce la elongación de sonda catalizada por polimerasa para sondas apareadas, es decir las apareadas con el alelo en el extremo 3’-terminal, pero no para las sondas con apareamiento erróneo. El patrón de intensidades de señal de ensayo que representa el rendimiento de reacciones de elongación de sonda individuales según este formato eMAP™ (véase el documento US 2004/0002073 A1, citado anteriormente) , se convierte en un patrón de reacción diferenciado, mediante la aplicación de umbrales preestablecidos, a razones (u otras combinaciones) de intensidades de señal de ensayo asociadas con sondas dentro de un par de sondas dirigidas contra cada marcador.

Entonces, un genotipo se representa mediante una sucesión, G = { (NV) ik} en la que i enumera los genes en el conjunto de genes de interés seleccionados, y k enumera sitios polimórficos designados dentro del gen i-ésimo, y en el que el par (NV)... [Seguir leyendo]

1. Método de selección de un donante de transfusión mediante la determinación de la compatibilidad con un receptor comparando combinaciones de marcadores polimórficos en un conjunto de tales marcadores, de donantes candidatos y un receptor en el que dicha determinación se realiza tras someter material genómico/ADN de donantes candidatos y el receptor a amplificación para generar de ese modo productos amplificados, en el que los productos amplificados se someten a un ensayo de hibridación o a un ensayo de elongación mediado por captura o a ambos, en el que se genera una señal de ensayo por los eventos de hibridación o elongación individuales, según sea aplicable, mediante pares de sondas en las que los miembros del par son complementarios, en su totalidad o en parte, a las subsecuencias de los productos amplificados que son los mismos que y/o que son complementarios a los marcadores polimórficos en el conjunto;

en el que se genera un patrón de intensidad de señal de ensayo a partir de eventos de hibridación o 15 elongación, de modo que cada marcador en el conjunto está representado por un par de intensidades de señal de ensayo particulares, comprendiendo el método:

determinar el patrón de intensidad de señal de ensayo generado a partir de dicho ensayo de hibridación o elongación y formar, para cada par de sondas, una combinación de intensidades de señal asociadas con los miembros del par;

generar a partir de dichas combinaciones de intensidades de señal una serie de valores, cada valor en la serie seleccionado de uno de tres posibles valores, que indican respectivamente un estado homocigótico normal, heterocigótico u homocigótico variante para formar de ese modo un patrón de reacción;

determinar las combinaciones de marcadores polimórficos representadas por dichos patrones de reacción; y

seleccionar de los donantes candidatos un donante que tiene dicha combinación de marcadores polimórficos idéntica a la del receptor,

en el que la combinación de intensidades de señal de miembros se representa de modo que una intensidad de este tipo, iN, se correlaciona con la cantidad de marcador normal en la muestra, y la otra intensidad de 35 este tipo, iV, se correlaciona con la cantidad de marcador variante en la muestra, y dichas intensidades se combinan para formar un parámetro de discriminación  = (iN-iV) / (iN+iV) que varía entre -1 y 1.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el patrón de reacción se genera designando valores del parámetro de discriminación por debajo de un primer umbral como valor inferior, designando valores del parámetro de discriminación por encima de un segundo umbral como valor superior, y designando valores del parámetro de discriminación por debajo del segundo umbral pero por encima del primer umbral como valor intermedio.

3. Método según la reivindicación 2, en el que el ensayo es un ensayo de hibridación en el que el patrón de

intensidad de señal se convierte en el patrón de reacción formando razones de intensidades de señal asociadas con un par y designando la muestra como homocigótica para el marcador para razones por encima de un primer umbral y designando la muestra como homocigótica para el marcador para un alelo variante para razones por debajo de un segundo umbral y designando la muestra como heterocigótica para las razones de marcador por debajo del primer umbral y por encima del segundo umbral.

4. Método de identificación de un donante de transfusión analizando un conjunto de marcadores polimórficos que comprende:

someter material genético del donante a un ensayo en el que pares de sondas generan una señal de 55 ensayo;

medir las señales de ensayo y formar una combinación de intensidades de señal para una pluralidad de los pares de sondas;

generar, a partir de las combinaciones de intensidades de señal, un patrón de reacción de una serie de valores que representan homocigótico normal, homocigótico variante o heterocigótico;

determinar combinaciones de marcadores polimórficos representadas por el patrón de reacción; y

identificar el donante de transfusión que tiene combinaciones de marcadores polimórficos compatibles con combinaciones de marcadores polimórficos de un receptor;

en el que el ensayo es un ensayo de hibridación, un ensayo de elongación mediado por captura o ambos, y

dichas sondas son complementarias, en su totalidad o en parte, a los marcadores polimórficos, en el que la

combinación de intensidades de señal comprende una primera intensidad, iN, que representa la cantidad de

5 marcador normal, y una segunda intensidad, iV, que representa la cantidad de marcador variante, y un

parámetro de discriminación de = (iN-iV) / (iN+iV) se calcula a partir de la combinación de intensidades de

señal.

5. Método según la reivindicación 4, en el que el patrón de reacción se genera designando valores del

10 parámetro de discriminación por debajo de un primer umbral como homocigótico normal, designando

valores del parámetro de discriminación por encima de un segundo umbral como homocigótico variante, y

designando valores del parámetro de discriminación por debajo del segundo umbral pero por encima del

primer umbral como heterocigótico.