Procedimiento para controlar la carga de soluto de micropartículas poliméricas.

Un procedimiento para modular la carga de tinte de micropartículas poliméricas que comprende:

a) proporcionar:

i. al menos un primer disolvente en el que sean solubles el tinte y el polímero de micropartícula;

ii. al menos un segundo disolvente en que no sean solubles o solo débilmente el tinte y elpolímero de micropartícula, siendo dichos primer y segundo disolventes inmiscibles o comomáximo parcialmente miscibles;

iii. al menos un tercer disolvente en que no sean solubles o solo débilmente el tinte y el polímerode micropartícula, siendo dicho tercer disolvente miscible con el primer y segundodisolventes;

b) formar una suspensión de dichas micropartículas poliméricas en un volumen designado de una mezclaque comprende al menos un segundo disolvente y al menos un tercer disolvente;

c) añadir a dicha suspensión de micropartículas poliméricas una disolución que comprende un tintedisuelto en dicho primer disolvente, con lo que el soluto se capta por las micropartículas;

d) añadir de forma continua o semicontinua el segundo disolvente a la suspensión de micropartículaspara modular de forma continua o semicontinua la concentración de tinte en la micropartícula ycontrolar así la captación y concentración final de tinte en las micropartículas.

Campo de la invención La invención se refiere a un procedimiento para modular la carga de tinte de micropartículas poliméricas.

Antecedentes de la invención Las partículas poliméricas que contienen un soluto retenido, por ejemplo tinte, se usan ampliamente como marcadores para biomoléculas y como referencia interna y patrones de calibración para procedimientos de detección de ensayo tales como citometría de flujo. Se han descrito cuatro procedimientos generales en la técnica anterior para producir partículas poliméricas fluorescentes: (A) copolimerización de tinte y monómero; (B) reparto de tintes hidrosolubles u oleosolubles en partículas preformadas; (C) funcionalización superficial de partículas preformadas y (D) encapsulación de gotitas de tinte. Además, se han usado también procedimientos de polimerización para preparar partículas de núcleo y cubierta, es decir, micropartículas compuestas por un núcleo polimérico y una cubierta polimérica.

A. Procedimientos basados en la copolimerización Las micropartículas fluorescentes pueden sintetizarse mediante la polimerización de unidades monoméricas formando micropartículas en presencia de tintes fluorescentes. La patente de EE.UU. 4.326.008 de Rembaum (1982) describe la síntesis de micropartículas fluorescentes mediante la copolimerización de un monómero acrílico funcionalizado con un comonómero fluorescente polimerizable. El procedimiento requiere generalmente una molécula de tinte polimerizable. Dichos procedimientos padecen generalmente el inconveniente de la posible inhibición de la polimerización por el tinte fluorescente y/o el apagamiento de la fluorescencia por los constituyentes reactivos de la reacción de polimerización.

El documento US 5.244.630 A describe un dispositivo desechable adecuado para efectuar ensayos de diagnóstico en fase sólida automatizados que emplea micropartículas para complejar un analito.

El documento US 5.288.577A hace referencia a un revelador de tipo seco que está compuesto por partículas de tóner sustancialmente esféricas eléctricamente aislantes y partículas portadoras.

El documento US 6.503.680 B1 da a conocer un proceso que utiliza una composición de látex estándar (universal) y que implica el reparto de agente de transferencia de drenaje y la polimerización en emulsión, que proporcionan un polímero de látex con un amplio intervalo de propiedades moleculares.

El documento US 5.301.044 A se refiere a materiales, procedimientos y sistemas de copia en los que se obtiene información mediante al menos un identificador contenido en materiales de marcado que forman una imagen que se escanea por un sistema de copia.

El documento US 6.494.924 B1 da a conocer colorantes precipitados no hidrosolubles en forma dispersa coloidal.

El documento US 2002/0032252 A1 hace referencia a una dispersión de partículas coloreadas, a tinta para registro por inyección de tinta usando la misma y a un procedimiento de registro por inyección de tinta.

La patente de EE.UU. 4.267.235 de Rembaum (1981) describe la síntesis de microesferas de poliglutaraldehído usando polimerización en suspensión. Se usa isotiocianato de fluoresceína (FITC) cosolubilizado para crear microesferas 2

fluorescentes. La polimerización por condensación en suspensión del monómero con moléculas de tinte cosolubilizadas, aunque evita en gran medida la destrucción del tinte y la inhibición de la polimerización, genera una distribución amplia de tamaño de partícula y por tanto no es una vía adecuada para la producción de microesferas fluorescentes monodispersadas. La patente de EE.UU. 5.073.498 de Schwartz y col. (1991) describe un proceso para preparar micropartículas fluorescentes mediante polimerización por siembra. Se disuelven uno o más tintes fluorescentes hidrófobos en una disolución que contiene monómero e iniciador. Se añade la disolución a micropartículas prehinchadas. La patente da a conocer procedimientos que permiten la introducción de tres tintes diferentes en una partícula. El procedimiento padece el inconveniente de la posible inhibición de la polimerización por el tinte fluorescente,

o a la inversa el apagamiento de la fluorescencia por el proceso de polimerización.

La polimerización en emulsión multietapa se ha empleado para preparar partículas de núcleo y cubierta sin grupos funcionales superficiales. La patente de EE.UU. 5.952.131 de Kumaceheva y col. da a conocer un procedimiento para preparar partículas de núcleo y cubierta teñidas. El procedimiento está basado en múltiples etapas de polimerización semicontinua de una mezcla de dos monómeros (metacrilato de metilo y dimetacrilato de etilenglicol) y un tinte fluorescente (metacrilato de metilo marcado con 4-amino-7-nitrobenzo-2-oxa-1, 3-diazol) . Las partículas se encapsulan entonces con una cubierta externa mediante la copolimerización de metacrilato de metilo y metacrilato de butilo en presencia de un agente de transferencia de cadena, dodecilmercaptano. Kumaceheva y col. no preparan ni tienen como objeto la inclusión de un producto polimérico de núcleo y cubierta con grupo funcional superficial.

La patente de EE.UU. 4.613.559 de Ober y col. da a conocer un procedimiento para preparar tóner coloreado por hinchamiento. Se preparan partículas de poliestireno (de 5, 5 μm) mediante polimerización en dispersión de estireno en presencia de etanol, poli (ácido acrílico) , Methylcellosolve y peróxido de benzoílo. El hinchamiento se efectúa dispersando el poliestireno en una disolución acuosa de dodecilsulfato de sodio y acetona. Las partículas coloreadas se obtienen añadiendo una disolución de tinte emulsionado (Passaic Oil Red 2144 en cloruro de metileno emulsionado con una disolución acuosa de dodecilsulfato de sodio) a la dispersión de partículas.

Se han empleado procedimientos de polimerización para preparar partículas de núcleo y cubierta que contienen grupos funcionales superficiales. La patente de EE.UU. 5.395.688 de Wang y col. da a conocer partículas poliméricas fluorescentes magnéticamente sensibles que comprenden un núcleo polimérico recubierto con una capa de polímero que contiene óxido metálico magnéticamente sensible. La cubierta polimérica final se sintetiza con un monómero funcional para facilitar el acoplamiento covalente con materiales biológicos. El procedimiento de Wang y col. está basado en tres etapas: (1) preparación de partículas de núcleo fluorescentes; (2) encapsulación de óxido metálico en una cubierta de poliestireno formada sobre el núcleo fluorescente mediante polimerización de radicales libres en ausencia de emulsionante pero con un exceso de iniciador y (3) recubrimiento de las partículas fluorescentes magnéticas con una capa de polímero funcional. El polímero funcional tiene grupos carboxilo, amino, hidroxilo o sulfónico. Wang y col. no describen un procedimiento para obtener el núcleo coloreado y tampoco se enfrentan al problema de la destrucción del tinte durante el proceso de polimerización por radicales libres.

La patente de EE.UU. 4.829.101 de Kraemer y col. da a conocer partículas fluorescentes de 2 μm obtenidas mediante polimerización de núcleo y cubierta. El núcleo se obtiene a 80 ºC mediante la polimerización de una mezcla de metacrilato de isobutilo, metacrilato de metilo y dimetacrilato de etilenglicol mediante iniciación con persulfato de amonio. La cubierta se sintetiza sobre el núcleo mediante adición semicontinua, en una primera etapa, de una mezcla de los mismos monómeros que contienen un tinte fluorescente (verde flúor-dorado) . Hacia el final de la reacción, se añaden dos mezclas monoméricas diferentes durante un periodo de una hora: una primera mezcla que contiene 3

metacrilato de metilo, bismetacrilato de etilenglicol y metacrilato de glicidilo, y una segunda mezcla que contiene metacrilamida e iniciador. Se inicia la polimerización con ácido 4, 4'-azobis (cianovalérico) .

Okubo y col., Colloid Polym. Sci. 269: 222-226 (1991) , Yamashita y col., Colloids and Surfaces A., 153: 153-159 (1999) y la patente de EE.UU. 4.996.265 describen la producción de partículas poliméricas monodispersadas de tamaño micrométrico mediante polimerización por dispersión con siembra. Las partículas de siembra de polímero se prehinchan con grandes cantidades de monómero antes de la polimerización por siembra. El hinchamiento se lleva a cabo mediante la adición gota a gota lenta y continua de agua a una mezcla de etanol-agua que contiene las partículas de siembra, monómeros, estabilizador e iniciador. La adición de agua reduce la solubilidad del monómero en la fase continua, conduciendo a la precipitación y posterior absorción del monómero sobre o en las partículas... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para modular la carga de tinte de micropartículas poliméricas que comprende:

a) proporcionar: 5 i. al menos un primer disolvente en el que sean solubles el tinte y el polímero de micropartícula;

ii. al menos un segundo disolvente en que no sean solubles o solo débilmente el tinte y el polímero de micropartícula, siendo dichos primer y segundo disolventes inmiscibles o como máximo parcialmente miscibles;

iii. al menos un tercer disolvente en que no sean solubles o solo débilmente el tinte y el polímero 10 de micropartícula, siendo dicho tercer disolvente miscible con el primer y segundo disolventes; b) formar una suspensión de dichas micropartículas poliméricas en un volumen designado de una mezcla que comprende al menos un segundo disolvente y al menos un tercer disolvente; c) añadir a dicha suspensión de micropartículas poliméricas una disolución que comprende un tinte 15 disuelto en dicho primer disolvente, con lo que el soluto se capta por las micropartículas;

d) añadir de forma continua o semicontinua el segundo disolvente a la suspensión de micropartículas para modular de forma continua o semicontinua la concentración de tinte en la micropartícula y controlar así la captación y concentración final de tinte en las micropartículas.

2. El procedimiento según la reivindicación 1 que incluye adicionalmente la etapa de retirar al menos una porción de dichas micropartículas de la suspensión en un intervalo de tiempo durante el transcurso de dicha adición del segundo disolvente, proporcionando conjuntos de micropartículas que difieren en la concentración de tinte.

3. Un procedimiento de producción de micropartículas poliméricas teñidas que comprende: 25 a) proporcionar:

i. al menos un primer disolvente en el que sean solubles el tinte y el polímero de micropartícula;

ii. al menos un segundo disolvente en que no sean solubles o solo débilmente el tinte y el polímero de micropartícula, siendo dichos primer y segundo disolventes inmiscibles o como máximo parcialmente miscibles;

iii. al menos un tercer disolvente en que no sean solubles o solo débilmente el tinte y el polímero de micropartícula, siendo dicho tercer disolvente miscible con el primer y segundo disolventes; b) formar una suspensión de dichas micropartículas poliméricas en un volumen designado de una mezcla que comprende al menos un segundo disolvente y al menos un tercer disolvente;

c) añadir a dicha suspensión de micropartículas poliméricas una disolución que comprende un tinte disuelto en dicho primer disolvente, con lo que el soluto se capta por las micropartículas proporcionando una suspensión de mezcla maestra de micropartículas caracterizada por una primera concentración de dicho tinte en las micropartículas;

d) crear dos o más alícuotas a partir de dicha suspensión de mezcla maestra de micropartículas que 40 contengan cantidades añadidas seleccionadas del segundo disolvente para cambiar la cantidad de reparto de tinte en micropartículas poliméricas en dichas alícuotas; y e) incubar las alícuotas de suspensión de micropartículas durante un periodo de tiempo de modo que la cantidad de reparto de tinte en las micropartículas, para una concentración de tinte inicial dada en la disolución de tinte, se determine por la cantidad del segundo disolvente añadida a las alícuotas de suspensión de micropartículas.

4. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que la etapa de creación de dichas dos o más alícuotas de suspensión de micropartículas que contienen cantidades añadidas seleccionadas del segundo disolvente comprende dividir la mezcla maestra de suspensión de micropartículas en dos o más alícuotas, y añadir cantidades seleccionadas del segundo disolvente a dichas alícuotas.

5. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que la etapa de creación de dichas dos o más alícuotas de suspensión de micropartículas que contienen cantidades añadidas seleccionadas del segundo disolvente comprende añadir de forma continua o semicontinua el segundo disolvente a la mezcla maestra de suspensión de micropartículas y retirar al menos una porción de dicha mezcla maestra en un intervalo de tiempo durante el transcurso de dicha adición del segundo disolvente, formando dos o más alícuotas de suspensión de micropartículas que contienen cantidades añadidas seleccionadas del segundo disolvente.

6. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que el tinte es un tinte fluorescente.

7. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que el tinte es un tinte hidrófobo.

8. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que el tinte se selecciona del grupo consistente en tintes de estirilo, tintes de pirrometano, tintes de cumarina y combinaciones de los mismos.

9. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que las micropartículas comprenden un polímero hidrófobo.

10. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que el polímero es un homopolímero o copolímero que comprende un monómero que contiene vinilo.

11. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que el polímero se selecciona del grupo consistente en homopolímeros o copolímeros de poliestireno, poli (metacrilato de metilo) , poliacrilamida, polietilenglicol, poli (metacrilato 30 de hidroxietilo) , poliviniltolueno, polidivinilbenceno y combinaciones de los mismos.

12. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que el polímero es poliestireno o un copolímero del mismo que contiene al menos un 50 % en peso de unidades de monómero de estireno.

13. El procedimiento según la reivindicación 12, en el que el polímero es un copolímero de estireno/ácido metacrílico.

14. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que el polímero está reticulado.

15. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que las micropartículas tienen un diámetro de aproximadamente 0, 1 a aproximadamente 100 μm.

16. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que las partículas están monodispersadas.

17. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que la concentración de tinte presente en la suspensión de micropartículas formada poniendo en contacto las micropartículas con dicha disolución de tinte es de aproximadamente 10 μg/g a aproximadamente 100 μg/g, basado en el peso de la suspensión de micropartículas.

18. El procedimiento según la reivindicación 9, que comprende un disolvente en el que el primer disolvente se selecciona del grupo consistente en cloruro de metileno, cloroformo, tetrahidrofurano, dioxano, ciclohexano, benceno, tolueno, acetato de butilo, hidrocarburos alifáticos clorados inferiores y combinaciones de los mismos; el segundo disolvente es agua y el tercer disolvente se selecciona del grupo consistente en acetona, alcoholes inferiores y combinaciones de los mismos.

19. El procedimiento según la reivindicación 18, en el que el primer disolvente es cloruro de metileno o diclorometano, y el segundo disolvente es un alcohol.

20. El procedimiento según la reivindicación 16, en el que el tercer disolvente es alcohol.

21. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que la micropartícula es una micropartícula de núcleo y cubierta que comprende un núcleo central que comprende uno o más polímeros de núcleo rodeado por una cubierta que comprende uno o más polímeros de cubierta.

22. El procedimiento según la reivindicación 21, en el que el polímero de núcleo comprende un copolímero de estireno y un monómero más hidrófilo que el estireno.

23. El procedimiento según la reivindicación 21, en el que el polímero de núcleo comprende ácido metacrílico.

24. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que al menos una porción de las micropartículas es magnéticamente sensible.