Glicoproteína hialuronidasa soluble (sHASEGP), proceso para prepararla, usos y composiciones farmacéuticas que la comprenden.

Un polipéptido de hialuronidasa substancialmente purificado, donde:

el polipéptido contiene al menos un resto de azúcar que está covalentemente unido a un residuo de asparraguina (N) del polipéptido;

el polipéptido es activo neutro;

el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 98% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos descrita como aminoácidos 1-448 de la SEC. Nº ID.: 4; y

el polipéptido es soluble.

Glicoproteína hialuronidasa soluble (sHASEGP), proceso para prepararla, usos y composiciones farmacéuticas que la comprenden.

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere a lo expuesto en las reivindicaciones y en general se relaciona con glicoproteinas hialuronidasa solubles activas a pH neutro (sHASEGP), porciones de las mismas, particularmente dominios hialuronidasa. La memoria describe modificaciones químicas, composiciones farmacéuticas, plásmidos de expresión, métodos para la fabricación y métodos terapéuticos que usan las glicoproteinas hialuronidasas y dominios de las mismas y las moléculas de ácido nucleico codificantes para la modificación terapéutica de glicosaminoglicanos en el tratamiento de una enfermedad y para el uso para aumentar la difusión de otras moléculas inyectadas de menos de 200 nanómetros de diámetro en un animal.

Información anterior

Los glicosaminoglicanos (GAG) son polisacáridos lineales complejos de la matriz extracelular (ECM). Los GAG se caracterizan por estructuras disacáridas repetidas de una hexosamina N-sustituida y un ácido uránico, [hialuronano (HA), sulfato de condroitina (CS), condroitina (C), sulfato de dermatán (DS), sulfato de heparán (HS), heparina (H)], o una galactosa, [sulfato de queratán (KS)]. Excepto por el HA, todos se presentan unidos covalentemente a proteínas de núcleo. Los GAG con sus proteínas de núcleo se denominan estructuralmente proteoglicanos (PG).

El hialuronano (HA) se encuentra en mamíferos predominantemente en tejidos conjuntivos, piel, cartílago y en líquido sinovial. El hialuronano también es el constituyente principal del humor vitreo del ojo. En el tejido conjuntivo, el agua de hidratación asociada con el hialuronano genera espacios entre tejidos, generando de este modo un entorno que conduce a movimiento y proliferación celular. El hialuronano desempeña un papel clave en fenómenos biológicos asociados con la motilidad celular incluyendo el desarrollo rápido, regeneración, reparación, embriogénesis, desarrollo embrionario, cicatrización de heridas, angiogénesis y oncogénesis (Toole 1991 Cell Bioll Extracell. Matrix, Hay (ed ), Plenum Press, Nueva York, 1384-1386; Bertrand et al. 1992 Int. J. Cáncer 52: 1-6; Knudson et al, 1993 FASEB J. 7: 1233-1241). Además, los niveles de hialuronano se correlacionan con la agresividad tumoral (Ozello et al. 1960 Cáncer Res. 20: 600-604; Takeuchi et al. 1976, Cáncer Res. 36: 2133-2139; Klmata et al. 1983 Cáncer Res.43: 1347-1354).

El HA se encuentra en la matriz extracelular de muchas células, especialmente en tejidos conjuntivos blandos. Al HA se le han asignado diversas funciones fisiológicas, tales como en la homeostasis del agua y de proteínas plasmáticas (Laurent TC et al (1992) FASEB J 6: 2397-2404). La producción de HA aumenta en células en proliferación y puede desempeñar un papel en la mitosis. También se ha implicado en la locomoción y en la migración celular. El HA parece desempeñar papeles importantes en la regulación, desarrollo y diferenciación celular (Laurent et al, anteriormente).

El HA se ha usado en la medicina clínica. Su propiedades Teológicas y protectoras de tejidos han demostrado utilidad en la cirugía oftálmica para proteger el endotelio corneal durante la cirugía de cataratas. El HA sérico es diagnóstico de enfermedad hepática y diversas afecciones inflamatorias, tales como artritis re6umatoide. El edema intersticial causado por acumulación de HA puede causar disfunción en diversos órganos (Laurent et al, anteriormente).

Las interacciones proteicas del hialuronano también están implicadas en la estructura de la matriz extracelular o "sustancia fundamental".

Las hialuronidasas son un grupo de enzimas activas a pH neutro y a pH ácido que se encuentran por todo el reino animal. Las hialuronidasas varían con respecto a la especificidad de sustrato y mecanismo de acción.

Existen tres clases generales de hialuronidasas:

1. Hialuronidasas de tipo mamífero, (EC 3.2.1.35) que son endo-beta-N-acetilhexosaminidasas con tetrasacáridos y hexasacáridos como los productos finales principales. Tienen actividades tanto hidrolítica como transglicosidasa y pueden degradar el hialuronano y los sulfatos de condroitina (CS), en concreto C4-S y C6 -S.

2. Las hialuronidasas bacterianas (EC 4.2.99.1), degradan el hialuronano y en diversos grados CS y DS. Son endo- beta-N-acetilhexosaminidasas que funcionan mediante una reacción de beta-eliminación que produce principalmente productos finales disacáridos.

3. Las hialuronidasas (EC 3.2.1.36) de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos son endo-beta-glucuronidasas que generan productos finales tetrasacáridos y hexasacáridos a través de la hidrólisis del enlace beta 1-3.

Las hialuronidasas de mamífero pueden dividirse adicionalmente en dos grupos: enzimas activas a pH neutro y activas a pH ácido. Existen seis genes de tipo hialuronidasa en el genoma humano, HYAL1, HYAL2, HYAL3 HYAL4 HYALP1 y PH20/SPAM1. HYALP1 es un pseudogén y no se ha demostrado que HYAL3 posea actividad enzimática hacia ningún sustrato conocido. HYAL4 es una condroitinasa y carece de actividad hacia hialuronano. HYAL1 es la enzima activa a pH ácido prototípica y PH20 es la enzima activa a pH neutro prototfpica. Las hialuronidasas activas a pH ácido, tales como HYAL1 y HYAL2, carecen de actividad catalítica a pH neutro. Por ejemplo, la HYAL1 no tiene actividad catalítica in vitro sobre pH 4,5 (Frost et al Anal Biochemistry, 1997). HYAL2 es una enzima activa a pH ácido con una actividad específica muy baja in vitro.

Las enzimas de tipo hialuronidasa también pueden estar caracterizadas por las que están inmovilizadas en la membrana plasmática a través de un anclaje glicosilfosfatidilinositol tal como HYAL2 humana y PH20 humana (Danilkovitch-Miagkova, et al. Proc Nati Acad Sci USA. 15 de abril de 2003; 100 (8): 4580-5, Phelps et al., Science 1988) y las que son solubles, tales como HYAL1 humana (Frost et al, Biochem Biophys Res Commun. 9 de julio de 1997; 236 (1): 10-5). Sin embargo, existen variaciones entre especies: por ejemplo, la PFI20 bovina se unen muy débilmente a la membrana plasmática y no se ancla mediante un anclaje sensible a fosfolipasa (Lalancette et al, Biol Reprod., agosto 2001; 65 (2): 628-36.). Esta característica única de la hialuronidasa bovina ha permitido el uso de la enzima hialuronidasa de testículos bovinos soluble como un extracto para uso clínico (Wydase®, Hyalase®). Otras especies de PH20 son enzimas ancladas a llpidos que no son insolubles sin el uso de detergentes o lipasas. Por ejemplo, la PH20 humana se ancla a la membrana plasmática a través de un anclaje GPI. Los intentos para preparar construcciones de ADN de PH20 humana que no introducirían un anclaje lipldico en el polipéptido dieron como resultado una enzima catalíticamente inactiva o una enzima insoluble (Arming et al Eur J Biochem. 1 de Agosto de 1997;247 (3): 810-4). La hialuronidasa de esperma de macaco de origen natural se encuentra en forma tanto soluble como unida a membrana. Mientras que la forma unida a membrana de 64 kDa posee actividad enzimática a pH 7,0, la forma de 54 kDa sólo es activa a pH 4,0 (Cherr et al, Dev Biol. 10 de abril de 1996; 175 (1): 142-53). Por lo tanto, las formas solubles de PH20 carecen con frecuencia de actividad enzimática en condiciones neutras.

Gmachl et al., FEBS 336 (3): 545-548 (1993), describen la expresión recombinante de la proteína del esperma humano PH-20. Lin et al., JCB 125: 1157-1163 (1994), describen la expresión recombinante de una proteína de fusión de ratón y de mono cinomolgo PH-20-KT3.

Las condroitinasas son enzimas que se encuentran por todo el reino animal. Estas enzimas degradan los glicosaminoglicanos a través de una reacción endoglicosidasa. Los ejemplos específicos de condroitinasas conocidas incluyen condroitinasa ABC (obtenida de Proteus vulgaris; Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública N° 6-153947, T. Yamagata, H. Saito, O. Flabuchi y S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523 (1968), S. Suzuki, H. Saito, T. Yamagata, K. Anno, N. Seno, Y. Kawai, y T. Furuhashi, J. Biol. Chem., 243, 1543 (1968)), condroitinasa AC (obtenida de Flavobacterium heparinum; T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi y S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523 (1968)), condroitinasa AC II (obtenida de Arthrobacter aurescens; K. Hiyama y S. Okada, J. Biol. Chem., 250, 1824 (1975), K. Hiyama y S. Okada, J. Biochem. (Tokyo), 80, 1201 (1976)), hialuronidasa ACHI (obtenida de Flavobacterium sp. Hp102; Hirofumi Miyazono, Hiroshi Kikuchi, Keiichi Yoshida, Kiyoshi Morikawa y Kiyochika Tokuyasu, Seikagaku, 61, 1023 (1989)), condroitinasa B (obtenida de Flavobacterium eparinum;... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido de hialuronidasa substancialmente purificado, donde:

el polipéptido contiene al menos un resto de azúcar que está covalentemente unido a un residuo de asparraguina (N) del polipéptido; el polipéptido es activo neutro;

el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 98% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos descrita como aminoácidos 1-448 de la SEC. N°

ID.: 4; y

el polipéptido es soluble.

2. Un polipéptido de hialuronidasa substanclalmente purificado de la reivindicación 1, donde: el polipéptido está codificado por una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC. N° ID.: 1 que acaba en un residuo de aminoácido C-term¡nal que es el aminoácido 477, 478, 479, 480, 481, 482 ó 483 de la SEC. N° ID.: 1.

3. El polipéptido de hialuronidasa substanclalmente purificado de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que está modificado con un polímero.

4. El polipéptido de hialuronidasa substanclalmente purificado de la reivindicación 3, donde el polímero es PEG o dextrano.

5. Un método para producir un polipéptido de hialuronidasa substancialmente purificado de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, consistiendo el método en:

Introducir un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 operativamente unido a un promotor adecuado en una célula capaz de incorporar restos de azúcar unidos a N en el polipéptido; cultivar la célula en condiciones mediante las cuales el polipéptido codificado es expresado por la célula y segregado, y

recuperar el polipéptido expresado.

6. El método de la reivindicación 5, que incluye la purificación del polipéptido.

7. El método de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, donde el ácido nucleico consiste en la secuencia de nucleótidos 106-1446 de la SEC. N° ID.: 6, o una porción de la misma, que codifica un polipéptido catalíticamente activo, o

la molécula de ácido nucleico consiste en la secuencia de nucleótidos descrita en la SEC. N° ID.: 48, o codones degenerados de la misma.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5-7, donde la célula es una célula eucariótica.

9. El método de la reivindicación 8, donde la célula eucariótica es seleccionada entre una célula de mamífero, una célula de insecto o una célula de levadura.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5-9, donde la célula es una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO).

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5-10, donde el ácido nucleico está unido a un ácido nucleico codificante de una señal de secreción para la secreción del polipéptido codificado.

12. Una composición farmacéutica, que incluye el polipéptido de hialuronidasa substancialmente purificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 12, que además incluye un principio farmacéuticamente activo.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 13, donde el principio farmacéuticamente activo es seleccionado entre un agente quimioterapéutico, un agente analgésico, un agente antiinflamatorio, un agente antimicrobiano, un agente amebicida, un agente tricomonacida, un agente antiparkinson, un agente antipalúdico, un agente anticonvulsivante, un agente antidepresivo, un agente antiartrítico, un agente antifúngico, un agente antihipertensor, un agente antipirético, un agente antiparasitario, un agente antihistamínico, un agente agonista alfa- adrenérgico, un agente alfa-bloqueante, un agente anestésico, un agente dilatador bronquial, un agente biocida, un agente bactericida, un agente bacteriostático, un agente bloqueante beta-adrenérgico, un agente bloqueante de los canales del calcio, un fármaco cardiovascular, un agente contraceptivo, un agente descongestionante, un agente

diurético, un agente depresor, un agente diagnóstico, un agente electrolito, un agente hipnótico, un agente hormonal, un agente hiperglucémico, un agente relajante muscular, un agente contractor muscular, un agente oftálmico, un agente parasimpaticomimético, un agente energizante psíquico, un agente sedante, un agente simpaticomimético, un agente tranquilizante, un agente urinario, un agente vaginal, un agente virucida, un agente vitamínico, un agente antiinflamatorio no esteroideo, un agente inhibidor de la enzima conversora de la angiotensina, un polipéptido, una proteína, un ácido nucleico, un fármaco, una molécula orgánica y un inductor del sueño.

15. Una composición farmacéutica, que Incluye el polipéptido de hialuronidasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en la administración de una molécula terapéutica.

16. Una composición farmacéutica, que incluye el polipéptido de hialuronidasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en la eliminación del exceso de glicosaminoglicanos o de los glicosaminoglicanos acumulados para el tratamiento de una enfermedad o trastorno.

17. La composición farmacéutica de la reivindicación 16, donde el exceso de glicosaminoglicanos se produce tras ¡squemla-reperfuslón, Inflamación, arteriesclerosis, edema, cáncer, lesión de la médula espinal o cicatrización.

18. La composición farmacéutica de la reivindicación 12 para uso en el tratamiento de un tumor, donde la composición incluye además un agente anticanceroso seleccionado entre un agente quimioterapéutico, un anticuerpo, un péptido, un vector de terapia génica, un virus o una molécula de ADN.

19. La composición farmacéutica de la reivindicación 18 para uso en el tratamiento de un tumor, donde el agente anticanceroso es un anticuerpo.

20. La composición farmacéutica de la reivindicación 19 para uso en el tratamiento de un tumor, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

21. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20 para uso en el tratamiento de un tumor, donde el tumor es un cáncer de mama.