Compuestos fluorescentes.

Compuestos fluorescentes. La presente invención se dirige a los compuestos de formula I,

a un kit que comprende dichos compuestos y a su aplicación como agentes de tinción. Dichos compuestos están diseñados para que sean capaces de internalizarse en la célula viva, acumularse selectivamente en las mitocondrias y teñirlas de forma preferente a otros orgánulos celulares. Además tienen una elevada fotoestabilidad. Adicionalmente, los compuestos de la invención permiten ser aplicados en cultivos celulares, tanto cultivos primarios como líneas celulares, bien en células vivas o bien fijadas con parafornaldehido, manteniendo la eficacia de la tinción y su selectividad, permitiendo su uso en experimentos de visualización en tiempo real.

Compuestos fluorescentes

Sector de la técnica

La presente invención se dirige a los compuestos de fórmula I, a un kit que comprende dichos compuestos y a su aplicación como agentes de tinción.

Antecedentes de la invención

Las mitocondrias son responsables de la producción de más del 90% de la energía celular de los mamíferos y juegan un papel fundamental en la función celular y de ciertos tejidos. Debido a su implicación crítica en las células es importante la detección de las mismas y la identificación de su comportamiento, que depende del estado metabólico de la célula. En este sentido se han diseñado agentes de tinción fluorescentes selectivos para mitocondrias y varios son comerciales, por ejemplo el Mitotracker ® o el Rodaminal23.

La publicación Cáncer Research, 2002, 62, 7219-7229, describe difenilfurano diamidinas y cómo puede influir la incorporación de anillos aromáticos como grupos terminales de las cadenas laterales de la furamidina en la acumulación de dichos compuestos entre el núcleo y el citoplasma. En concreto, se describe que los derivados de furamidina que poseen un anillo aromático o heteioaromático en la posición terminal de una cadena lateral se acumulan más fácilmente en el citoplasma, mayoritariamente en las mitocondrias, a diferencia de los correspondientes derivados alquílicos que se acumulan selectivamente en el núcleo.

La reciente publicación Journal of the American Chemical Society, 2012, 135, 62-65, describe un compuesto que combina un grupo luminógeno de emisión inducida por agregación y dos grupos trifenilfbsfonio, que es conocido por dirigir la entrada de sondas a las mitocondrias. El compuesto resultante mostró especificidad por las mitocondrias y una fotoestabilidad más elevada que otros reactivos.

Sin embargo, los agentes de tinción comerciales presentan problemas y la industria busca constantemente agentes fluorescentes con propiedades mejoradas. Por ejemplo, en muchos casos estos agentes presentan una baja fotoestabilidad, pobre selectividad y/o insuficiente intemalizadón en las mitocondrias.

Descripción breve de la invención

Los autores de la presente invención han desarrollado nuevos compuestos con propiedades fluorescentes que los hacen adecuados para ser utilizados en investigación aplicada a células. Dichos compuestos están diseñados para que sean capaces de internalizarse en la célula viva, acumularse selectivamente en las mitocondrias y teñirlas de forma preferente a otros orgánulos celulares. Más concretamente, los autores encontraron que compuestos derivados de bis-amidinios con sistemas aromáticos extendidos son capaces de internalizarse en la célula con sorprendente efectividad y acumularse de forma selectiva en las mitocondrias. Además no tiñen otros orgánulos celulares, de manera que son adecuados para teñir selectivamente las mitocondrias. Además, los compuestos de la presente invención presentan sorprendentemente una elevada fotoestabilidad, de modo que pueden ser irradiados durante un tiempo prolongado sin que tenga lugar su fotodegradación, lo que permite un mayor tiempo de observación durante el experimento. La fotoestabilidad de estos compuestos permite diseñar una gran variedad de experimentos, por ejemplo irradiar la muestra en diferentes momentos durante el experimento o el estudio celular, irradiar la muestra durante tiempo prolongado, o combinar estos compuestos con otros reactivos durante el experimento.

Adicionalmente, los compuestos de la invención permiten ser aplicados en cultivos celulares, tanto cultivos primarios como líneas celulares, bien en células vivas o bien Ajadas con paraformaldehido, manteniendo la eficacia de la tinción y su selectividad, permitiendo su uso en experimentos de visualización en tiempo real (time-resolved fluorescencé).

Por otra parte, se ha comprobado con alguno de los compuestos de la invención, que no son citotóxicos, y que permiten monitorizar el proceso de reciclaje mitocondrial, lo que le confiere un valor añadido.

Así, en un aspecto la invención se dirige a compuestos de fórmula I

/

K

donde A y B se seleccionan cada uno independientemente de arilo y heteroarilo opcionalmente sustituidos,

cada uno de n, m, o, q se selecciona independientemente de 1,2, ó 3,

W se selecciona de entre enlace sencillo, alquilo, arilo y heteroarilo opcionalmente sustituidos,

Ri se selecciona de entre hidrógeno, hidroxilo, -OR\ -N(R)(R")-, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquinilo, arilo, heteroarilo, azido, tetrazino y un grupo fluoróforo aceptor,

K se selecciona de entre enlace sencillo, alquilo, -O-alquil-, -O-alquil-N(R)-, heterociclo y heteroarilo,

cada uno de Ra y Rb se selecciona independientemente de entre hidrógeno y un grupo protector fotolábil,

cada uno de P| y P2 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo C|- C12, arilo C6-Ci5, heteroarilo C3-C15 y heterociclo C3-C15 opcionalmente sustituidos, NO2, CN, halógeno, -OR, -SR\ -S(0)R\ -S(0)2R, -0S(0)2R\ -N(R)(R"), - C(0)R, -C(0)0R\ -C(0)N(R)(R"), -0C(0)R y - N(R)C(0)R\ cada R y R" se selecciona independientemente de hidrógeno, alquilo C|-C6, cicloalquilo C3-C7, arilo C6-C15, heteroarilo C3-C15 y heterociclo C3-C15 opcionalmente sustituidos,

y comprende al menos un anión orgánico o inorgánico para mantener la neutralidad. En otro aspecto la invención se dirige a un kit para el estudio celular que comprende un compuesto de fórmula I como se ha descrito anteriormente.

En otro aspecto la invención se dirige al uso de un compuesto de fórmula I como se ha descrito anteriormente, como reactivo de fluorescencia o agente de tinción.

En otro aspecto la invención se dirige a un método para teñir mitocondrias o un componente mitocondrial, que comprende incubar una muestra, donde dicha muestra

comprende mitocondrias o un componente mitocondrial, con una solución acuosa de un compuesto de fórmula I tal y como se define arriba, donde dicho compuesto está en una cantidad suficiente para teñir mitocondrias o un componente mitocondrial y la incubación tiene lugar durante un tiempo suficiente para detectar fluorescencia.

Un aspecto adicional de la invención es un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula I,

K

y

'Rb

que comprende la reducción de un compuesto de fórmula IX

y opcionalmente el acoplamiento con un grupo protector fotolábil, donde A, B, Pi, P2, m, n, o , q, W, K, Ri, Ra, Rb son como se han definido anteriormente, y comprende al menos un anión orgánico o inorgánico para mantener la neutralidad.

Un aspecto adicional de la invención son los compuestos de fórmula IX y X utilizados como intermedios en la síntesis de los compuestos de fórmula I.

Descripción de las figuras

Figura 1. Arriba: Estructura del Compuesto (3). Abajo: Espectro de emisión de fluorescencia en agua del Compuesto (3). Longitud de onda de excitación 329 nm, el espectro es recogido de 385 a 600 nm.

Figura 2. Fila superior: Izquierda: Células CEF incubadas con Compuesto (3) 5pM y observadas en el canal del azul a 1000X. Centro: Células CEF incubadas con MitoTracker 500 nM y observadas en el canal del rojo a 1000X. Derecha: Superposición de ambas imágenes que demuestra la localización mitocondrial del Compuesto (3) en un cultivo primario. Fila inferior: Mismo protocolo realizado sobre células VERO fijadas con para-formaldehído.

Figura 3. Columna Izquierda: Diferentes líneas celulares incubadas con Compuesto (3) 5pM, observadas en el canal del azul a 1000X. Columna Central: Mismas líneas celulares incubadas con MitoTracker 500 nM, observadas en el canal del rojo a 1000X. Columna Derecha: Superposición de ambas imágenes que demuestra la localización mitocondrial del Compuesto (3) en diferentes líneas inmortales.

Figura 4. Arriba: Células Vero incubadas con Rodaminal23 2pM durante 30 min y observadas en el canal del verde a 1000X a tiempo 0, 30 y 60 segundos. Medio: Células Vero incubadas con MitoTracker 500 nM durante 30 min y observadas en el canal del rojo a 1000X a tiempo 0, 30 y 60 segundos. Abajo: Células Vero incubadas con Compuesto (3) 5 pM durante 30 min y observadas en el canal del rojo a 1000X a tiempo 0, 2 y 8 minutos.

Figura 5. Izquierda: Células Vero incubadas con Compuesto (3) 5pM observadas en el canal del azul a 1000X tras 24 horas. Centro: Células Vero incubadas con Rodaminal23 2pM antes de ser observadas en el canal del verde a 1000X. Derecha: Superposición de ambas imágenes que demuestra la no localización mitocondrial del Compuesto (3) al cabo de 24 horas.

Figura... [Seguir leyendo]

1. Compuesto de fórmula I

donde A y B se seleccionan cada uno independientemente de arilo y heteroarilo opcionalmente sustituidos,

cada uno de n, m, o, q se selecciona independientemente de 1,2, ó 3,

W se selecciona de entre enlace sencillo, alquilo, arilo y heteroarilo opcionalmente sustituidos,

Ri se selecciona de entre hidrógeno, hidroxilo, -OR\ -N(R)(R")-, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquinilo, arilo, heteroarilo, azido, tetrazino y un grupo fluoróforo aceptor,

K se selecciona de entre enlace sencillo, alquilo, -O-alquil-, -0-alquil-N(R)-, heterociclo y heteroarilo,

cada uno de Ra y Rb se selecciona independientemente de entre hidrógeno y un grupo protector fotolábil,

cada uno de Pj y P2 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo Ci-C12, arilo C6-Ci5, heteroarilo C3-C15 y heterociclo C3-C15 opcionalmente sustituidos, N02, CN, halógeno, -OR\ -SR, -S(0)R\ -S(0)2R\ -0S{0)2R, -N{R)(R"), -C(0)R, - C(0)0R\ -C{0)N(R)(R"), -0C(0)R y - N(R)C(0)R",

cada R y R" se selecciona independientemente de hidrógeno, alquilo CrC6, cicloalquilo C3-C7, arilo C6-C|5, heteroarilo C3-C15 y heterociclo C3-C15 opcionalmente sustituidos,

y comprende al menos un anión orgánico o inorgánico para mantener la neutralidad.

2. Compuesto de fórmula la según la reivindicación 1,

Ra

Rb

la

3.

4.

6.

donde A, B, Ra, Rb, K, Rj, Pj, P2, m, n, o , q son como se han definido en la reivindicación 1, y comprende al menos un anión orgánico o inorgánico para mantener la neutralidad.

Compuesto de fórmula Ib según la reivindicación 1,

en donde A, B, Ra, Rb, P|, P2, m, n, o y q son como se han definido en la reivindicación 1, y comprende al menos un anión orgánico o inorgánico para mantener la neutralidad, y en donde los anillos C y D son heterociclos.

Compuesto de fórmula le según la reivindicación 1,

en donde A, B, Ra, Rb, P|, P2, m, n, o , q son como se han definido en la reivindicación 1, y comprende al menos un anión orgánico o inorgánico para mantener la neutralidad.

Sal trifluoroacética de 6,6-[l,3-propanodi-il-di(imino)]dinaftaleno carboximidamida. Compuesto de fórmula Ih según la reivindicación 1,

K

-Ri

'Rb

donde A, B, Ra, Rb, K, Ri, Pi, P2, m, n, o , q son como se han definido en la reivindicación 1, y comprende al menos un anión orgánico o inorgánico para mantener la neutralidad.

7. Procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula I,

-Ri

K

Rb

que comprende la reducción de un compuesto de fórmula IX

Rl

/

K

Rb

y opcionalmente el acoplamiento con un grupo protector fotolábil, donde A, B, Pi, P2, m, n, o, q, W, K, R|, Ra, Rb son como se han definido en la reivindicación 1, y comprende al menos un anión orgánico o inorgánico para mantener la neutralidad.

8. Kit para el estudio celular que comprende un compuesto de fórmula I tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

9. Uso de un compuesto de fórmula I tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, como reactivo de fluorescencia o agente de tinción.

10. Uso según la reivindicación 9, donde el reactivo es selectivo para mitocondrias.

11. Método para teñir mitocondrias o un componente mitocondrial, que comprende incubar una muestra, donde dicha muestra comprende mitocondrias o un componente mitocondrial, con una solución acuosa de un compuesto de fórmula I tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho compuesto de fórmula I está en una cantidad suficiente para teñir mitocondrias o un componente mitocondrial y la incubación tiene lugar durante un tiempo suficiente para detectar fluorescencia.

12. Método según la reivindicación 11, que comprende además una etapa de fijación.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 y 12, que comprende además una etapa de permeabilización.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, donde el tiempo de incubación es entre 20 y 60 minutos.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, que comprende además añadir un reactivo adicional a la muestra, donde dicho reactivo adicional es un reactivo que produce una respuesta detectable debido a un componente celular específico, sustancia intracelular, o una condición celular.

16. Método según la reivindicación 15, donde el reactivo adicional comprende una proteína, una secuencia de aminoácidos, un anticuerpo marcado y/o un oligonucleótido marcado.

17. Compuesto de fórmula IX tal y como se ha definido en la reivindicación 7.

18. Compuesto de fórmula X

H I H

donde W, K, R), A, B, Pi, P2, m, n, o , q son tal y como se han definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.