Utilización del gen KRIT1 en el campo de la angiogénesis.

Método de diagnóstico genotípico de cavernomas en un individuo,

caracterizado porque se extrae una muestra biológica de dicho individuo, porque se detecta la presencia de una mutación en el gen Krit1 que conduce a la expresión de una proteína Krit1 truncada por análisis de la secuencia nucleica presente en dicha muestra, estando dicha mutación relacionada con la aparición de cavernomas.

Utilización del gen KRIT1 en el campo de la angiogénesis.

La presente invención tiene por objeto un método de diagnóstico de los angiomas cavernosos o cavernomas para la detección de mutaciones en el gen Krit1. En particular, esta detección se lleva a cabo por medio de secuencias nucleotídicas tales como las definidas en la reivindicación 8.

Los cavernomas son unas malformaciones vasculares localizados frecuentemente en el sistema nervioso central, pero también en la retina, el hígado, los riñones, etc. y están caracterizados porque presentan unas cavidades capilares anormalmente agrandadas sin intervención de parénquima cerebral (Russell et al.) . Los síntomas clínicos incluyen cefaleas, hemorragias, crisis de epilepsia y deficiencias neurológicas focales. La prevalencia de los angiomas cavernosos es casi del 0, 5% en la población general (Otten et al.) . Estos angiomas pueden ser transmitidos de manera hereditaria en una forma autosómica dominante en cerca del 50% de los casos (Rigamonti et al.) . Se han identificado 3 localizaciones (o loci) de malformaciones cavernosas cerebrales (CCM) sobre el brazo largo del cromosoma 7, el brazo corto del cromosoma 7 y el brazo largo del cromosoma 3 (7q, 7p y 3q respectivamente) . Se observó un importante efecto fundador en la población hispano-americana, en la que todas las familias estaban unidas al locus CCM1 localizado en 7q (Rigamonti et al.; Oubovsky et al.; Gunel et al.; y Craig et al.) .

Laberge et al., 1998, (Eur. J. Hum. Gen., vol. 6/supl. 1, p. 146, P4.167) muestra que el locus CCM1, que comprende los genes CDK1, PAS1, HUMLD14 y KRIT1, está asociado a la presencia de cavernomas.

Los inventores han establecido recientemente las características genéticas y clínicas de los cavernomas, así como las características hereditarias en una serie de 57 familias francesas (Labauge et al.) . Unas investigaciones de formación de neuroimágenes han confirmado la gran frecuencia de lesiones múltiples en los cavernomas heriditarios. Asimismo, se puso en evidencia una correlación altamente significativa entre el número de lesiones y la edad del paciente, lo cual sugiere en gran medida la naturaleza dinámica de estas malformaciones vasculares denominadas también hamartomas. El análisis de unión llevado a cabo en 36 de estas familias ha mostrado que el 65% de ellas estaba relacionado al locus CCM1 sin ningún efecto fundador (Laberge et al.) .

El tamaño del intervalo genético que contiene el locus CCM1 se redujo en 1995 a 4 centimorgans, estando el locus CCM1 encuadrado por D7S2410 y D7S689 (Johnson et al.) . Mediante un enfoque in silico esencialmente, los inventores han establecido un mapa físico y transcripcional del intervalo de CCM1. Entre las 53 unidades transcripcionales cartografiadas en el interior de la región crítica, una de ellas correspondía a Krit1, un gen cuyo producto interactúa con Rap1A (también denominado Krev1) , un miembro de la familia de los genes Ras implicados en la proliferación celular, la diferenciación y la morfogénesis (Bos et al.) . Utilizando en combinación la técnica SSCP y la secuenciación, los inventores han identificado en 8 familias CCM1 no emparentadas unas mutaciones que conducen muy probablemente a una proteína Krit1 truncada. La cosegregación de estas mutaciones con el fenotipo afectado sugiere en gran medida que Krit1 es la proteína mutada en las familias que padecen cavernomas relacionados con el locus CCM1 y sugiere la implicación de la vía de transducción de la señal de Rap1A en la vasculogénesis y/o la angiogénesis.

Utilizando un contig de YAG previamente publicado, y las bases de datos de secuencias públicas (The Washington University Chromosome 7 Project) , los inventores han construido unos contigs de BAC/PAC que cubren el 90% del intervalo CCM1, estimado en 1600 kb (figura 1) . Se han utilizado 20 familias que comprenden 179 meiosis potencialmente informativas y de las que se había mostrado anteriormente que tenían una probabilidad a posteriori de estar relacionadas con el locus CCM1 superior al 90% para cartografiar finalmente este locus con unos marcadores polimorfos identificados por medio de las secuencias BAC/PAC (figura 1) . Un acontecimiento de recombinación observado en un individuo afectado (familia 27 en Labauge et al.) ha permitido a los inventores reducir ligeramente este intervalo, que está ahora encuadrado por M2456 (límite centromérico) y D7S689 (límite telomérico) . El cribado de bancos de datos públicos, tales como Gene Map del Human Genome, Unigene y dBEST ha permitido a los inventores cartografiar en el interior de este intervalo 574 Expressed Sequence Tags (EST) que después se agruparon en 53 unidades transcripcionales putativas que comprenden 6 genes ya conocidos: CDK6, HUMI.D14, KRIT1, PEX-1, mMTERF y Yotiao.

Krit1 se identificó durante un cribado destinado a identificar las proteínas que interactúan con Rap1A/Krev1, un miembro de la familia de los genes Ras (Serebriiski et al.) . Codifica para una proteína de 529 aminoácidos que comprende 4 dominios anquirinas e interactúa con Rap1A/Krev1 mediante su región carboxiterminal. Ya se ha indicado que el ARN mensajero de Krit1 estaba expresado a niveles bajos en numerosos tejidos, incluyendo el cerebro. Aunque la función exacta de Krit1 sea todavía desconocida, los inventores han considerado que era un buen gen candidato para CCM1, y esto por varias razones. Rap1A/Krev1A se ha identificado en base a su homología con Dras3, un homólogo de Ras en la drosofila, así como en base a su actividad anti-mitógena en unos fibroblastos transformados por K-ras (Pizon et al., 1988/Kitayama et al., 1989) . Aunque la pertinencia fisiológica de este efecto anti-mitógeno observado in vitro no se haya establecido aún in vivo, esto ha llevado a considerar que esta proteína era un antagonista de Ras. Una función de la vía de señalización de Ras en la vasculogénesis y la angiogénesis ha sido sugerida en gran medida por las anomalías vasculares observadas en los modelos murinos invalidados para las proteínas implicadas en esta vía, por ejemplo las proteínas raf o GAP120 (Henkemeyer et al., 1995; Wojnowski et al., 1997) . Además de este papel putativo como antagonista de Ras, Rap1A/Krev1 se implicó en la diferenciación celular y la morfogénesis (Asha et al., 1999;Quarck et al., 1996; Pizon et al., 1988) .

En otras palabras, en la medida en que la proteína Krit1 truncada da lugar a una anomalía de la angiogénesis que se acompaña de una proliferación de las células endoteliales, es razonable deducir que el gen Krit1 podría tener un papel de control de la angiogénesis.

Así, en el marco de la presente invención, los inventores han demostrado que unas mutaciones en el gen Krit1, susceptibles de dar lugar a una proteína Krit1 truncada son responsables de la aparición de anomalías vasculares. Estas anomalías vasculares pueden afectar a diferentes territorios, que incluyen el cerebro y la piel, y adoptar diferentes formas (carvernomas, agiomas capilar-venosos) . El tipo de lesiones observadas (desarrollo de enfermedades vasculares anormales combinado con la naturaleza de las mutaciones observadas (mutaciones que conllevan un truncado de la proteína) sugieren en gran medida que esta proteína ejerce un control de la angiogénesis que podría ser susceptible de aplicaciones terapéuticas en el campo de la antiangiogénesis, en particular en el campo tumoral.

La alineación del ADNc de Krit1 con el BAC AC000020, uno de los BAC localizado en el intervalo, ha permitido a los inventores determinar la estructura genómica de Krit1. Este gen está codificado por 12 exones que están todos comprendidos en el BAC AC000020. Los inventores han diseñado los cebadores oligonucleotídicos intrónicos destinados a amplificar los exones (tabla nº 1) así como las secuencias de unión (tabla nº 2) . Estos cebadores han sido particularmente delicados de elaborar debido a la riqueza en bases A y T de Krit1 y porque son muy específicos de Krit1. Así, se describen en la presente memoria los cebadores de secuencia nucleotídica seleccionada de entre el grupo que comprende SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 3, SEC ID nº 4, SEC ID nº 5, SEC ID nº 6, SEC ID nº 7, SEC ID nº 8, SEC ID nº 9, SEC ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 13, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15, SEC ID nº 16, SEC ID nº 17, SEC ID nº 18, SEC ID nº 19, SEC ID nº 20, SEC ID nº 21, SEC ID nº 22, SEC ID nº 23, SEC ID nº 24, SEC ID nº 25, SEC ID nº 26, SEC ID n° 27, SEC ID nº 28.

Mediante estos cebadores, los inventores han podido amplificar todos los exones. Un conjunto de 20 pacientes CCM no emparentados, que pertenecen a unas familias en las que el análisis HOMOG ha mostrado una probabilidad a posteriori para estar... [Seguir leyendo]

1. Método de diagnóstico genotípico de cavernomas en un individuo, caracterizado porque se extrae una muestra biológica de dicho individuo, porque se detecta la presencia de una mutación en el gen Krit1 que conduce a la expresión de una proteína Krit1 truncada por análisis de la secuencia nucleica presente en dicha muestra, estando dicha mutación relacionada con la aparición de cavernomas.

2. Método de diagnóstico según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico es ADN genómico, ADNc o ARNm.

3. Método de diagnóstico según una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque dicho análisis se realiza por hibridación.

4. Método de diagnóstico según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho análisis se realiza por secuenciación.

5. Método de diagnóstico según una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque dicho análisis se realiza por migración electroforética, y más particularmente por SSCP o DGGE.

6. Método de diagnóstico según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se amplifica la totalidad o parte de la secuencia de ácido nucleico que corresponde al gen Krit1 previamente a la detección de la presencia de una mutación.

7. Método de diagnóstico según la reivindicación 6, caracterizado porque la amplificación se realiza por PCR.

8. Método de diagnóstico según la reivindicación 7, caracterizado porque los cebadores para realizar la amplificación están entre las secuencias seleccionadas de entre el grupo que comprende SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 3, SEC ID nº 4, SEC ID nº 5, SEC ID nº 6, SEC ID nº 7, SEC ID nº 8, SEC ID nº 9, SEC ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 13, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15, SEC ID nº 16, SEC ID nº 17, SEC ID nº 18, SEC ID nº 19, SEC ID nº 20, SEC ID nº 21, SEC ID nº 22, SEC ID nº 23, SEC ID nº 24, SEC ID nº 25, SEC ID nº 26, SEC ID nº 27, SEC ID nº 28.

9. Método de diagnóstico según las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque los pares de cebadores para realizar la amplificación se seleccionan de entre el grupo que comprende:

-SEC ID nº 1/SEC ID nº 2 para el exón 1,

-SEC ID nº 3/SEC ID nº 4 para el exón 2,

-SEC ID nº 5/SEC ID nº 6 para el exón 3,

-SEC ID nº 7/SEC ID nº 8 para el exón 4,

-SEC ID nº 9/SEC ID nº 10 para el exón 5,

-SEC ID nº 11/SEC ID nº 12 para el exón 6,

-SEC ID nº 13/SEC ID nº 14 para el exón 7,

-SEC ID nº 15/SEC ID nº 16 para el exón 8,

-SEC ID nº 17/SEC ID nº 18 para el exón 9,

-SEC ID nº 19/SEC ID nº 20 para el exón 10,

-SEC ID nº 21/SEC ID nº 22 para el exón 10,

-SEC ID nº 23/SEC ID nº 24 para el exón 11,

-SEC ID nº 25/SEC ID nº 26 para el exón 12,

-SEC ID nº 27/SEC ID nº 28 para el exón 12.

10. Utilización de por lo menos un cebador de secuencia nucleotídica para la detección, a partir de una extracción biológica, de la presencia de una mutación en el gen Krit1 susceptible de conducir a una proteína Krit1 truncada, y siendo dicho cebador seleccionado de entre el grupo que comprende SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 3, SEC ID nº 4, SEC ID nº 5, SEC ID nº 6, SEC ID nº 7, SEC ID nº 8, SEC ID nº 9, SEC ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 13, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15, SEC ID nº 16, SEC ID nº 17, SEC ID nº 18, SEC ID n° 19, SEC ID nº 20, SEC ID nº 21, SEC ID nº 22, SEC ID nº 23, SEC ID nº 24, SEC ID nº 25, SEC ID nº 26, SEC ID nº 27, SEC ID nº

28.

11. Utilización según la reivindicación 10, para la detección, a partir de una extracción biológica, de la presencia de una mutación en el gen Krit1 relacionada con la aparición de cavernomas.

12. Utilización según una de las reivindicaciones 10 y 11, caracterizada porque la detección de la mutación se efectúa en por lo menos un exón del gen Krit1.

13. Utilización según la reivindicación 12, caracterizada porque un par de secuencias es específica de un exón según la distribución siguiente:

-SEC ID nº 1/SEC ID nº 2 para el exón 1,

-SEC ID nº 3/SEC ID nº 4 para el exón 2,

- SEC ID nº 5/SEC ID nº 6 para el exón 3, 5 -SEC ID nº 7/SEC ID nº 8 para el exón 4,

-SEC ID nº 9/SEC ID nº 10 para el exón 5,

-SEC ID nº 11/SEC ID nº 12 para el exón 6,

-SEC ID nº 13/SEC ID nº 14 para el exón 7,

-SEC ID nº 15/SEC ID nº 16 para el exón 8.

10. SEC ID nº 17/SEC ID nº 18 para el exón 9,

-SEC ID nº 19/SEC ID nº 20 para el exón 10,

-SEC ID nº 21/SEC ID nº 22 para el exón 10,

-SEC ID nº 23/SEC ID nº 24 para el exón 11,

-SEC ID nº 25/SEC ID nº 26 para el exón 12.

15. SEC ID nº 27/SEC ID nº 28 para el exón 12.

14. Utilización según una de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizada porque la detección de una mutación está precedida por la amplificación del exón en el que se busca la mutación.

15. Utilización según la reivindicación 14, caracterizada porque la amplificación se realiza por PCR.