Una biblioteca de genes estructurales modificados o de partículas modificadas de cápside útiles para la identificación de clones virales con tropismo celular deseado.

Un método para la producción de una biblioteca de ácidos nucleicos que comprende una multiplicidad mayor a 105 genes estructurales expresables de al menos un virus eucariota,

que comprende las etapas de:

a) proporcionar un conjunto de ácidos nucleicos, donde cada uno codifica al menos un gen estructural de un virus eucariota y que comprende una secuencia adecuada de empaquetamiento, en donde el gen estructural contiene un inserto (2) que previene la formación de una proteína estructural funcional, y

b) la inserción de un inserto (1) en el gen estructural para remover una secuencia del gen estructural, en donde la secuencia removida comprende o es parte del inserto (2) formando así genes estructurales potencialmente funcionales;

en donde los genes estructurales son genes cap de un virus no empaquetado, y en donde dicho virus no empaquetado es un parvovirus,

en donde el virus es AAV y en donde el inserto (1) se inserta después de un ácido nucleico correspondiente a cualquier sitio dentro de los primeros 1 a 50 aminoácidos del terminal amino, o correspondiente a las posiciones e loa aminoácidos 261, 381, 447, 534, 573 y/o 587 de la proteína de la cápside VP1, preferiblemente a la posición del aminoácido 447 o 587, en donde la numeración de los aminoácidos se refiere a la proteína VP1 de AAV2.

Una biblioteca de genes estructurales modificados o de partículas modificadas de cápside útiles para la identificación de clones virales con tropismo celular deseado.

La presente invención se refiere a ciertas bibliotecas que contienen genes modificados de la cápside del parvovirus útiles para la identificación de cápsides del parvovirus capaces de transducir tipos de células predefinidos así como a métodos para la producción de los mismos.

El control del tropismo del vector (redireccionamiento) representa una preocupación crítica en el desarrollo de sistemas de transferencia de genes virales para terapia génica: para permitir la transferencia eficiente de los genes terapéuticos a las células objetivo y para evitar la transducción de tipos de células no deseadas. Los esfuerzos para lograr estos objetivos condujeron a la descripción de varios enfoques encaminados a proporcionar viriones con la capacidad de interactuar con receptores celulares específicos. Uno de estos enfoques incluye el acoplamiento de partículas virales con moléculas de enlazamiento del receptor, lo que resulta en vectores redireccionados con especificidad mejorada. Una gran desventaja de esta tecnología es, sin embargo, que estas moléculas de redireccionamiento podrían desprenderse de las cápsides, restaurando el tropismo natural de los viriones.

Un enfoque diferente consiste en la modificación genética de la cápside viral o de las proteínas de la envoltura mediante mutagénesis dirigida al sitio, principalmente mediante mutagénesis insercional.

Para todos estos procedimientos, la etapa crítica es la escogencia de moléculas de redireccionamiento funcionales. Este problema ha sido planteado en varios estudios mediante el aprovechamiento de la tecnología de despliegue en fagos para seleccionar gran número de péptidos por la capacidad deseada de enlazamiento con receptores específicos o tipos de células. Sin embargo, la introducción de moléculas extrañas a nivel de la estructura externa del vector puede perturbar la integridad de las partículas virales, dando como resultado títulos bajos o preparaciones virales ineficientes. Además, estos péptidos ligandos podrían perder completa o parcialmente su afinidad por el receptor pretendido una vez introducidos en la arquitectura del vector. Una solución elegante a este problema ha sido propuesta para los vectores adenovirales (Pereboev A. et al. (2001) J. Viro 75 (15) , 7107 - 7113) . En esta publicación se describe la expresión del botón de fibra de Adenovirus sobre la superficie de fagos pJuFo, lo que permite la visualización de secuencias aleatorias de polipéptidos en un contexto que imita el microambiente del vector de destino. Sin embargo, no se puede superar una limitación fisiológica de las bibliotecas basadas en fagos: las moléculas se pueden seleccionar exclusivamente sobre la base de su capacidad de enlazamiento, mientras que la optimización de la captación y el procesamiento de las partículas virales dentro de la célula no puede llevarse a cabo.

Los parvovirus y especialmente el virus adenoasociado (AAV) han recibido una creciente atención como un vector para terapia génica, debido a su falta de patogenicidad, su baja inmunogenicidad, y su capacidad para infectar tanto células en división como aquellas que no se dividen y para facilitar una expresión a largo plazo de los genes terapéuticos. Además, AAV es capaz de integrar un sitio específicamente en el genoma de la célula infectada sin menoscabo de ninguna función celular.

Una gran desventaja de la utilización de parvovirus y otros virus en terapia génica es el hecho de que estos virus sólo son capaces de transducir eficientemente tipos específicos de células, mientras que otros tipos de células son resistentes contra una infección por parvovirus. Especialmente, AAV2 sólo es capaz de transducir células que tienen de proteoglicanos de heparán sulfato (HSPG) en su superficie (Girod A. et al. (1999) Nature Medicine 5 - 9, 1052 1056) . Como se mencionó anteriormente, el control del tropismo viral es crucial para la transferencia efectiva de los genes terapéuticos a las células objetivo y para la prevención de una transducción de tipos de células no deseadas.

En la publicación Girod A. et al. ( (1999) Nature Medicine 5 - 9, 1052 - 1056) se ha demostrado recientemente que es posible modificar la estructura externa de un virus adenoasociado con el fin de proporcionarle a la cápside la capacidad de interactuar con receptores celulares que no son reconocidos por el virus de tipo silvestre. Este procedimiento puede llevarse a cabo mediante la inserción de una secuencia de ligando a nivel de un sitio específico de la proteína de la cápside viral, que está presente en la superficie externa de la cápside. Como locus adecuado, se identificó la posición del aminoácido 587 de la proteína principal de la cápside viral (VP1) de AAV2. La inserción en este sitio de la secuencia L14, un péptido que contiene el motivo RGD (una porción del fragmento PI de laminina) , proporcionándole al mutante AAV así obtenido (L14-AAV) la capacidad de infectar células B16F10. Las células B16F10 expresan una integrina y son, debido a la falta de expresión de proteoglicanos de heparán sulfato en la membrana celular exterior, resistente a la infección con wtAAV2.

Hasta la fecha, no existe un sistema que permite la identificación rápida de virus mutados, especialmente los parvovirus que son capaces de infectar un tipo de célula, pero son incapaces de infectar a otros tipos de células. Tal sistema es muy necesario para la obtención de parvovirus específicos de un tipo de célula para ser utilizados en terapia génica.

En consecuencia, un objetivo de la presente invención es proporcionar sistemas para la identificación de mutantes de AAV, que son capaces de infectar a otros tipos de células a los virus de tipo silvestre correspondientes. Además, un objetivo de la presente invención es proporcionar métodos para la preparación de tales sistemas.

La presente invención se refiere por lo tanto, en un primer objetivo a un método para la producción de una biblioteca de ácidos nucleicos que comprenden una multiplicidad superior a 105 genes estructurales expresables a partir de al menos un virus eucariota, que comprende las etapas de:

a) proporcionar un conjunto de ácidos nucleicos, donde cada uno codifica al menos un gen estructural de un virus eucariota y que comprende una secuencia adecuada de empaquetamiento, en donde el gen estructural contiene un inserto (2) que previene la formación de una proteína estructural funcional, y

b) la inserción de un inserto (1) en el gen estructural para remover una secuencia del gen estructural, en donde la secuencia removida comprende o es parte del inserto (2) formando así genes estructurales potencialmente funcionales;

en donde los genes estructurales son genes cap de un virus no empaquetado, y en donde dicho virus no empaquetado es un parvovirus,

en donde el virus es AAV y en donde el inserto (1) se inserta después de un ácido nucleico correspondiente a cualquier sitio dentro de los primeros 1 a 50 aminoácidos del terminal amino, o correspondiente a las posiciones e loa aminoácidos 261, 381, 447, 534, 573 y/o 587 de la proteína de la cápside VP1, preferiblemente a la posición del aminoácido 447 o 587, en donde la numeración de los aminoácidos se refiere a la proteína VP1 de AAV2.

De acuerdo con la presente invención y divulgación, respectivamente, la expresión "gen estructural" se refiere a un gen que codifica una o más proteínas, preferiblemente proteínas estructurales de una cápside viral ya sea de un virus con envoltura o a un gen que codifica una o más proteínas, preferiblemente proteínas estructurales de una envoltura viral de los virus con envoltura.

La invención se refiere además a una biblioteca de ácidos nucleicos que comprende una multiplicidad de genes estructurales expresables a partir de al menos un AAV, obtenible por el método anterior.

La biblioteca de la invención contiene una multiplicidad de ácidos nucleicos con diferentes genes estructurales que pueden expresarse con el fin de formar partículas virales infecciosas con un tropismo para diferentes tipos de células. Dado un cierto tipo de célula, es posible por lo tanto, cribar la biblioteca en busca de AAV mutantes, que son capaces de infectar ese tipo específico de célula.

De acuerdo con la invención, el término "proteína de la cápside" significa una proteína codificada por un gen cap, mientras que "proteína funcional de la cápside" significa una proteína de la cápside de un virus capaz de infectar al menos una célula huésped.

En caso de AAV, la proteína de... [Seguir leyendo]

1. Un método para la producción de una biblioteca de ácidos nucleicos que comprende una multiplicidad mayor a 105 genes estructurales expresables de al menos un virus eucariota, que comprende las etapas de:

a) proporcionar un conjunto de ácidos nucleicos, donde cada uno codifica al menos un gen estructural de un virus eucariota y que comprende una secuencia adecuada de empaquetamiento, en donde el gen estructural contiene un inserto (2) que previene la formación de una proteína estructural funcional, y

b) la inserción de un inserto (1) en el gen estructural para remover una secuencia del gen estructural, en donde la secuencia removida comprende o es parte del inserto (2) formando así genes estructurales potencialmente funcionales;

en donde los genes estructurales son genes cap de un virus no empaquetado, y en donde dicho virus no empaquetado es un parvovirus,

en donde el virus es AAV y en donde el inserto (1) se inserta después de un ácido nucleico correspondiente a cualquier sitio dentro de los primeros 1 a 50 aminoácidos del terminal amino, o correspondiente a las posiciones e loa aminoácidos 261, 381, 447, 534, 573 y/o 587 de la proteína de la cápside VP1, preferiblemente a la posición del aminoácido 447 o 587, en donde la numeración de los aminoácidos se refiere a la proteína VP1 de AAV2.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la biblioteca de ácidos nucleicos comprende una multiplicidad mayor a 106 genes estructurales expresables.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que los genes cap son de AAV1 , AAV2 , AAV3 , AAV4 , AAV5 o AAV6.

4. El método de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el conjunto de ácidos nucleicos se deriva de un ácido nucleico.

5. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, en el que el inserto (2) impide la formación de una proteína estructural funcional por que contiene un codón de detención.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que mediante la inserción del inserto (1) se elimina el codón de detención.

7. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, en el que el número de nucleótidos del inserto (1) y/o del inserto (2) , preferentemente del inserto (1) y del inserto (2) , es tres o un múltiplo de tres.

8. El método de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el virus es AAV y en el que el inserto (1) se inserta después de un ácido nucleico correspondiente a cualquier sitio dentro de los primeros 1 a 50 aminoácidos del terminal amino.

9. El método de la reivindicación 1 a 7, en el que el virus es AAV y en el que el inserto (1) se inserta después de un ácido nucleico que corresponde a las posiciones de los aminoácidos 261, 381, 447, 534, 573, y/o 587 de la proteína de la cápside VP1, preferiblemente a la posición del aminoácido 447 o 587.

10. El método de las reivindicaciones 1 a 9, en el que inserto (1) es generado al azar o parcialmente al azar.

11. El método de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el inserto (1) no contiene ningún codón de detención.

12. El método de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la biblioteca tiene una multiplicidad de mutantes virales que es mayor a 105, especialmente mayor a 106.

13. Una biblioteca de ácidos nucleicos que comprende una multiplicidad de genes estructurales expresables, en la que dichos genes estructurales son genes cap de un parvovirus, en donde el parvovirus es un AAV,

en donde la multiplicidad de genes estructurales expresables es mayor a 105, y en donde dicha biblioteca puede ser obtenida por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12,

en donde las secuencias de ácido nucleico insertadas se insertan después de un ácido nucleico correspondiente a cualquier sitio dentro de los primeros 1 a 50 aminoácidos del terminal amino de VP1, o correspondiente a las posiciones de los aminoácidos 261, 381, 447, 534, 573, y / o 587 de VP1, preferiblemente a la posición del aminoácido 447 o 587, en donde la numeración de los aminoácidos se refiere a la proteína VP1 de AAV2.

14. La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la multiplicidad de los genes estructurales expresables es mayor a 106.

15. La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, en donde la biblioteca tiene una multiplicidad de mutantes virales que es mayor a 106.

16. La biblioteca de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en la que el ácido nucleico es un ácido nucleico lineal, un plásmido, una partícula viral o un vector viral, por ejemplo, un vector de AAV recombinante.

17. La biblioteca de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en la que el ácido nucleico comprende además secuencias de empaquetamiento tales como las ITR de AAV y por lo menos un gen expresable que proporciona las funciones necesarias para la replicación y el empaquetamiento de viriones tal como una proteína Rep de AAV.

18. La biblioteca de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en la que el ácido nucleico es ADN.

19. La biblioteca de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, en la que el gen cap se deriva de uno de los serotipos de AAV del grupo que comprende AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 y AAV6.

20. La biblioteca de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, en la que una multiplicidad de secuencias de ácido nucleico se insertan en al menos un sitio del gen cap, en donde el número de nucleótidos insertados es de tres o un múltiplo de tres.

21. La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 20, en la que las secuencias de ácido nucleico insertadas se generan de forma aleatoria, especialmente utilizando codones NNN, codones NNB o codones NNK.

22. La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 20, en la que las secuencias de ácido nucleico insertadas se generan parcialmente al azar, especialmente mediante el uso de codones con uno, dos o tres nucleótidos fijos.

23. La biblioteca de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en la que las secuencias de ácido nucleico insertadas tienen una longitud de al menos 3 nucleótidos, preferiblemente de al menos 9, especialmente de al menos 18 nucleótidos.

24. La biblioteca de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en la que las secuencias de ácido nucleico insertadas se insertaron utilizando endonucleasas estándar de restricción o sistemas de recombinación, preferentemente los sistemas de recombinación cre/lox o Gateway o técnicas de reacción en cadena de la polimerasa, preferiblemente utilizando cebadores degenerados.

25. La biblioteca de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, en la que las secuencias de ácido nucleico insertadas conducen a una inserción de aminoácidos en la proteína estructural VP1, VP2 y/o VP3, en un sitio que se encuentra en la superficie de la cápside.

26. La biblioteca de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25, en la que las secuencias de ácido nucleico insertadas se insertan después de un ácido nucleico correspondiente a las posiciones de los aminoácidos 261, 381, 447, 534, 573, y / o 587 de VP1, preferiblemente en la posición del aminoácido 447 o 587.

27. La biblioteca de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 26, en la que el gen cap tiene al menos una mutación adicional que conduce por ejemplo a al menos una mutación puntual, al menos una supresión, inserción y/o sustitución interna de uno o varios aminoácidos o al menos una supresión, inserción y/o sustitución del terminal N o C de uno o varios aminoácidos ácidos, o una combinación de estas mutaciones, preferiblemente una mutación que inhibe el enlazamiento de proteoglicano de heparán sulfato, integrina y/o el enlazamiento del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) .

28. La biblioteca de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 27, en la que el gen cap tiene una inserción constante adicional de al menos un codón secuencia arriba y / o secuencia abajo del sitio de inserción de la secuencia de ácido nucleico insertada, preferiblemente de uno o dos o tres codones que codifican para Ala, Gly, Leu, Ile, Asp y/o Arg, especialmente una inserción de tres Ala secuencia arriba y dos Ala secuencia abajo del sitio de inserción.

29. Una biblioteca de viriones de AAV con modificaciones de la proteína de la cápside, en la que la biblioteca de viriones comprende la biblioteca de la ácidos nucleicos de las reivindicaciones 15 a 28.