PROTEÍNA ESTRUCTURAL DE VAA, PRODUCCIÓN Y USO DE LA MISMA.

Proteína estructural de virus adenoasociados (VAA), caracterizada porque la proteína estructural contiene al menos una mutación,

causada por una o varias inserciones localizada en la proteína estructural VP3 antes y/o después de al menos un aminoácido en la secuencia seleccionada de YKQIS SQSGA, YLTLN NGSQA, YYLSR TNTPS, EEKFF PQSGV, NPVAT EQYGS, LQRGN RQAAT, NVDFT VDTNG

Proteína estructural de VAA, producción y uso de la misma.

La presente invención se refiere a una proteína estructural de un virus adenoasociado (VAA), que contiene al menos una mutación, que provoca un aumento de la infecciosidad.

El virus VAA pertenece a la familia de los Parvovirus. Éstos se caracterizan por una cápside icosaédrica no envuelta con un diámetro que representa desde 18 hasta 30 nm, que contiene ADN lineal de cadena simple de aproximadamente 5 kb. Para una multiplicación eficaz de VAA es necesaria una coinfección de la célula huésped con virus auxiliares, por ejemplo con adenovirus, herpesvirus o virus Vaccinia. En ausencia de un virus auxiliar el VAA pasa a un estado latente, pudiendo el genoma del virus integrarse de manera estable en el genoma de la célula huésped. La característica de VAA, de integrarse en el genoma de la célula huésped, lo hace especialmente interesante como vector de transducción para células de mamíferos. Para las funciones del vector bastan generalmente ambas secuencias de repetición terminales invertidas de aproximadamente 145 pb de longitud (ITR: "Inverted Terminal Repeats", Repeticiones terminales invertidas). Éstas llevan las señales necesarias "cis" para la replicación, empaquetamiento e integración en el genoma de la célula huésped. Para el empaquetamiento en partículas recombinantes de vector, se transfecta un plásmido de vector, que porta los genes para proteínas no estructurales (proteínas rep) y para proteínas estructurales (proteínas cap), en células apropiadas de empaquetamiento, por ejemplo, las células Hela o 293, que después se infectan con un adenovirus.

Después de algunos días se obtiene un lisado, que contiene partículas recombinantes de VAA.

La cápside de VAA se compone de tres proteínas distintas: VP1, VP2 y VP3, cuyos porcentajes relativos son el 5% de VP1, el 5% de VP2 y el 90% de VP3. Los genes de la cápside de VAA se localizan en el extremo terminal derecho del genoma de VAA y se codifican a través de secuencias superpuestas del mismo marco de lectura abierto (ORF, Open Reading Frame) utilizando distintos codones de iniciación. El gen de VP1 contiene la secuencia genética completa de VP2, que a su vez contiene la secuencia genética completa de VP3 con una región de extremo N-terminal específica. El hecho, de que los marcos de lectura abiertos superpuestos codifican para las tres proteínas de la cápside de VAA, es responsable de la expresión obligatoria de todas las proteínas de la cápside, aunque con porcentajes distintos.

Las masas moleculares de las proteínas de la cápside son 87 kD para VP1, 73 kD para VP2 y 62 kD para VP3. Las secuencias de los genes de la cápside se describen por ejemplo en Srivastava, A. et al. (1983), J. Virol., 45, 555-564; Muzyczka, N. (1992), Curr. Top. Micro. Immunol., 158, 97-129, Ruffing, N. et al. (1992), J. Virol., 66, 6922-6930 o Rutledge, E. A. et al. (1998) J. Virol. 72, 309-319. El mapa genético y físico del genoma de VAA ha sido descrito, por ejemplo, por Kotin, R. M. (1994), Human Gene Therapy, 5, 793-801.

Además se conocen diferentes serotipos de VAA, de los cuales el serotipo 2 de VAA (VAA2) humano representa un vector vírico con propiedades favorables para la terapia génica somática. Las ventajas esenciales son la ausencia de patogenicidad para los humanos, la integración estable del ADN viral en el genoma celular, la capacidad de infectar células no divisorias, la estabilidad del virión, lo que posibilita la purificación hasta títulos elevados (10¹¹ partículas por ml), la baja inmunogenicidad así como la ausencia considerable de genes virales y productos génicos en el vector recombinante de VAA, que es ventajoso bajo aspectos de seguridad para el uso en la terapia génica. La clonación de genes en el vector de VAA se realiza entretanto según los métodos conocidos en general por el experto, tal como se describen, por ejemplo, en el documento WO 95/23 867, por Chiorini, J. A. et al. (1995), Human Gene Therapy, 6, 1531-1541 o por Kotin, R. M. (1994), véase anteriormente.

En general, el VAA2 tiene, por ejemplo, un espectro de acción amplio. Se infectan muy eficazmente (al 70-80%) los tejidos epiteliales, tales como líneas celulares tumorales epiteliales humanas, pero también material tumoral primario, tal como carcinoma ovárico o cervical o melanoma, y queratinocitos humanos, mientras que las células hematopoyéticas, tales como las células linfo-hematopoyéticas se infectan con una eficacia (el 0,5-5%) de 10 a 100 veces menor (Mass et al. (1998) Human Gene Therapy, 9, 1049-1059). Un motivo para esto podría ser que para la incorporación de VAA en la célula sea necesaria una interacción entre el VAA y un receptor de VAA en la superficie de la célula. Así por ejemplo el receptor de VAA2 primario putativo es una glicoproteína de membrana celular de 150 kD (Mizukami, H. et al. (1996), Virology, 217, 124-130) o un proteoglicano de heparán sulfato (Summerford, C. y Samulski, R. J. (1998), J. Virol., 72, 1438-1445). Se han determinado como receptores secundarios posibles: la integrina _αV_β5 (Summerford et al., (1999) Nature Medicine 5, 78-82) y el receptor 1 del factor de crecimiento del fibroblasto humano (Qing et al., (1999) Nature Medicine 5, 71-77). Estudios de enlace mostraron entonces que se reduce espesar la densidad de la superficie de este receptor sobre células que no se infectan eficazmente mediante VAA2.

Ahora se conoce que pueden introducirse sitios de unión para receptores en la cápside mediante una modificación genética de las proteínas de la cápside de retrovirus y adenovirus, que sólo se expresan en determinadas células y por consiguiente se ha posibilitado una selección como objetivo mediada por el receptor de vectores (véase por ejemplo Cosset, F. L. y Russell, S. J. (1996), Gene Ther., 3, 946-956, Douglas, J. T. et al. (1996), Nat. Biotechnol., 14, 1574-1578, Krasnykh, V. N. et al. (1996), J. Virol., 70, 6839-6846, Stevenson, S. C. et al. (1997), J. Virol., 71, 4782-4790 o Wickham, T. J. et al. (1996), Nat. Bitotechnol., 14, 1570-1573). En el documento WO 96/00587 se remite también a proteínas de fusión de la cápside de VAA, que deben contener antígenos clínicamente relevantes de epítopos heterólogos, mediante lo cual debe inducirse una respuesta inmunitaria y, que no deben interferir con la formación de la cápside. Sin embargo la publicación contiene sólo una indicación general sin datos más detallados de la viabilidad, especialmente de sitios de inserción apropiados. Steinbach et al. (1997) (Biol. Abstr. 104, Ref. 46570) se ocuparon del ensamblaje in vitro de partículas de VAA, que anteriormente se expresaron en el sistema de baculovirus. Se realizan también mutaciones en el gen cap, pero que no deben llevar a una modificación del tropismo, sino a un constructo de plásmidos, en el que sólo se expresa una proteína VP, respectivamente. No se menciona una modificación de la infecciosidad. Ruffing et al. (1994) (J. Gen. Virol. 75, 3385-3392) intentaron analizar el tropismo natural de VAA2. Para este fin se introdujeron mutaciones en el extremo C-terminal de la proteína VP de VAA2, habiéndose partido de la hipótesis (equivocada debido a datos de partida falsos), para modificar un motivo RGD. La mutación provocó únicamente una infecciosidad reducida.

Se conoce una selección indirecta como objetivo a partir de Bartlett et al. (1999; Nat. Biotechnol. 17, 181-186). A este respecto se usó un anticuerpo biespecífico, que se dirigía tanto contra la cápside de VAA2 como contra una célula diana. Sin embargo la cápside vírica ni se unió covalentemente ni se modificó ni se mutó una proteína de la cápside. Hasta el momento el único intento de selección directa como objetivo de VAA2 ha sido llevado a cabo por Yang et al. (1998; Hum. Gene Ther. 1, 1929-1937). A este respecto se fusionaron fragmentos de anticuerpos de cadena simple contra la molécula CD34 con el extremo N-terminal de VP2, se insertaron directamente en el extremo N-terminal de VP1. Este método muestra sin embargo dos inconvenientes claros. Por un lado el título infectante era muy bajo y por otro lado, debía expresarse conjuntamente la proteína de fusión para un empaquetamiento exitoso con proteínas de cápside VP1, VP2 y VP3 no mutadas. Sin embargo, de aquí se obtuvo como resultado una mezcla de proteínas de cápside de tipo natural y quiméricas, cuya composición y por tanto la acción no podrían preverse....

1. Proteína estructural de virus adenoasociados (VAA), caracterizada porque la proteína estructural contiene al menos una mutación, causada por una o varias inserciones localizada en la proteína estructural VP3 antes y/o después de al menos un aminoácido en la secuencia seleccionada de YKQIS SQSGA, YLTLN NGSQA, YYLSR TNTPS, EEKFF PQSGV, NPVAT EQYGS, LQRGN RQAAT, NVDFT VDTNG.

2. Proteína estructural según la reivindicación 1, caracterizada porque la(s) mutación (mutaciones) provoca un incremento de la infecciosidad del virus.

3. Proteína estructural según una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque la mutación se localiza en la superficie del virus.

4. Proteína estructural según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la proteína estructural mutada provoca una modificación de la interacción proteína-receptor de membrana celular.

5. Proteína estructural según la reivindicación 4, caracterizada porque el receptor de membrana celular es una glicoproteína de aproximadamente 150 kD y/o un proteoglicano de heparán sulfato.

6. Proteína estructural según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la proteína estructural mutada puede producir partículas.

7. Proteína estructural según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque ésta proviene de VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y/o VAA6.

8. Proteína estructural según la reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque la inserción es un ligando de receptor de membrana celular, un péptido o proteína rep, una proteína inmunosupresora o un péptido inmunosupresor y/o una proteína o un péptido con una señal para la síntesis de cadena doble del gen foráneo.

9. Proteína estructural según la reivindicación 8, caracterizada porque el ligando se selecciona de una integrina, de una citocina o de un dominio de unión a un receptor de una citocina, integrina o factor de crecimiento, un anticuerpo de cadena simple que se une a un receptor de la superficie celular, un anticuerpo contra las estructuras de la superficie celular, una estructura que se une a anticuerpos o un epítopo así como de ligandos, que se unen a través de su carga, el tipo de composición de los aminoácidos y/o a través de la glicosilación específica y/o fosforilación a moléculas de la superficie celular.

10. Proteína estructural según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque ésta se selecciona de VP1 mutada, VP2 mutada y/o VP3 mutada.

11. Proteína estructural según una de las reivindicaciones 1 a 10 en forma de una partícula de VAA, particularmente en forma de una cápside de VAA.

12. Ácido nucleico, que codifica para una proteína estructural según una de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Célula aislada, excepto una célula madre de embriones humanos que contiene un ácido nucleico según la reivindicación 12.

14. Procedimiento para la producción de una proteína estructural según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque se cultiva una célula según la reivindicación 13 y dado el caso se aísla la proteína estructural expresada.

15. Fármaco, que contiene una proteína estructural según una de las reivindicaciones 1 a 11, un ácido nucleico según la reivindicación 12 y/o una célula según la reivindicación 13.

16. Procedimiento diagnóstico, que contiene una proteína estructural según una de las reivindicaciones 1 a 11, un ácido nucleico según la reivindicación 12 y/o una célula según la reivindicación 13.

17. Uso in vitro de una proteína estructural según una de las reivindicaciones 1 a 11 para la modificación del tropismo de VAA, para la transformación de una célula, para el diagnóstico, para ensayos de eficacia y/o para la selección genómica como objetivo.