Procedimiento para la producción de inmunoglobulinas humanizadas.

Un proceso para hacer una línea celular transfectada que comprende transfectar una célula con polinucleótidos y cultivar dicha célula transfectada,

dichos polinucleótidos codifican las cadenas pesada y ligera de una inmunoglobulina humanizada, en donde dicha inmunoglobulina humanizada tiene una región marco aceptora y regiones determinantes de complementariedad (CDR) de Kabat de una inmunoglobulina donante y se une a un antígeno, y además en donde dicha inmunoglobulina humanizada comprende al menos un aminoácido no de la CDR del marco de la cadena ligera de la inmunoglobulina donante que sustituye al aminoácido correspondiente en el marco aceptor, en una posición donde:

(a) el aminoácido en el marco aceptor es raro para dicha posición y el aminoácido correspondiente en el marco donante es común para dicha posición en secuencias de inmunoglobulinas humanas; o

(b) el aminoácido es adyacente a una de las CDR; o

(c) se predice que el aminoácido tenga un átomo de la cadena lateral capaz de interaccionar con las CDR de la inmunoglobulina humanizada.

Procedimiento para la producción de ¡nmunoglobulinas humanizadas Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a la combinación de tecnologías de ADN recombinante y anticuerpos monoclonales para desarrollar nuevos agentes terapéuticos y más particularmente, a la producción de anticuerpos no inmunógenos y a sus usos.

Antecedentes de la invención

En los mamíferos, la respuesta inmunitaria está mediada por dos tipos de células que interaccionan específicamente con material extraño, es decir, antígenos. Uno de estos tipos de células, las células B, es responsable de la producción de anticuerpos. La segunda clase de células, las células T, Incluyen una gran diversidad de subconjuntos celulares que controlan la función in vivo tanto de las células B como de una gran diversidad de otras células hematopoyétlcas, Incluidas las células T.

Una manera en la que las células T ejercen este control es mediante la producción de una linfocina conocida como ¡nterleucina-2 (IL-2), denominada originalmente factor de crecimiento de las células T. La función primarla de IL-2 parece ser la estimulación y el mantenimiento de las células T. De hecho, algunos inmunólogos creen que IL-2 puede encontrarse en el centro de la respuesta Inmunitaria completa ívéase. Farrar, J. y col., Immunol. Rev. 63: 129-166 (1982), que se Incorpora en la presente memoria por referencia).

Para ejercer sus efectos biológicos, IL-2 ¡nteracclona con un receptor de membrana específico de alta afinidad (Greene, W. y col., Proaress in Hematoloav XIV. E. Brown, Ed., Gruñe y Statton, Nueva York (1986), en las páginas 283 y siguientes). El receptor de IL-2 humana es una glucoproteína compleja de cadenas múltiples, teniendo una de las cadenas, conocida como el péptldo Tac, aproximadamente 55 kD de tamaño (véase, Leonard, W. y col., J. Biol. Chem.. 260: 1872 (1985), que se Incorpora en la presente memoria por referencia). Se ha aislado un gen que codifica esta proteína y predice un péptldo de 272 aminoácidos, con Inclusión de un péptido señal de 21 aminoácidos ívéase. Leonard, W. y col., Nature 311: 626 (1984)). Los 219 aminoácidos NH2 terminales de la proteína p55 Tac comprenden aparentemente un dominio extracelular (véase. Leonard, W. y col., Science. 230: 633-639 (1985), que se Incorpora en la presente memoria por referencia).

Gran parte de la dilucidación de la estructura y función del receptor de IL-2 humana y su función se debe al desarrollo de anticuerpos monoclonales específicamente reactivos. En particular, un anticuerpo monoclonal de ratón, conocido como antl-Tac (Uchlyama y col., J. Immunol. 126: 1393 (1981)) ha demostrado que se pueden detectar receptores de IL-2 en las células T, pero también en células de la familia monocltos-macrófagos, células Kupffer del hígado, células Langerhans de la piel y por supuesto, células T activadas. De forma Importante, las células T inactivas, las células B o los macrófagos circulantes no presentan típicamente el receptor de IL-2 (Herrmann y col., J. Exp. Med. 162: 1111 (1985)).

El anticuerpo monoclonal anti-Tac se ha utilizado también para definir funciones de los linfocitos que requieren interacción con IL-2 y se ha demostrado que Inhibe diversas funciones de las células T, Incluyendo la generación de linfocitos T citotóxicos y supresores en la estructura de la célula. Asimismo, sobre la base de estudios con anti- Tac y otros anticuerpos, se asocian actualmente una diversidad de trastornos con la expresión impropia de receptor de IL-2 por las células T, en particular la leucemia de las células T de los adultos.

Más recientemente, el receptor de IL-2 ha mostrado ser una diana ideal para enfoques terapéuticos novedosos para las enfermedades mediadas por las células T. Se ha propuesto que anticuerpos específicos del receptor de IL-2, tales como el anticuerpo monoclonal anti-Tac, se pueden utilizar bien sea solos o bien como un inmunoconjugado (p. eL con Ricina A, isótopos y similares) para separar eficazmente las células que llevan el receptor de IL-2. Estos agentes pueden, por ejemplo, eliminar teóricamente las células leucémicas que expresan el receptor de IL-2, ciertas células B, o células T activadas implicadas en un estado de enfermedad, permitir aun la retención de las células T normales maduras y sus precursores para asegurar la capacidad de montar una respuesta inmunitaria de las células T normales en caso necesario. En general, la mayoría de otros agentes específicos de las células T pueden destruir esencialmente todas las células T periféricas, lo que limita la eficacia terapéutica de los agentes. Globalmente, el uso de anticuerpos monoclonales apropiados específicos para el receptor de IL-2 puede tener utilidad terapéutica en enfermedades autoinmunitarias, trasplantes de órganos y cualquier respuesta no deseada por las células T activadas. De hecho, se han iniciado pruebas clínicas utilizando, p. ej., anticuerpos anti-Tac ívéase. en general, Waldman, T. y col., Cáncer Res. 45: 625 (1985) y Waldman, T., Science 232: 727-732 (1986), ambos incorporados en la presente memoria por referencia).

Desafortunadamente, el uso del anticuerpo antl-Tac y otros anticuerpos monoclonales no humanos presenta ciertos inconvenientes, en particular en regímenes terapéuticos repetidos como se explica más adelante. Los anticuerpos monoclonales de ratón, por ejemplo, no fijan bien el complemento humano y carecen de otras características funcionales Importantes de ¡nmunoglobullnas cuando se utilizan en seres humanos.

Quizás de manera más Importante, el anticuerpo antl-Tac y otros anticuerpos monoclonales no humanos contienen tramos sustanciales de secuencias de aminoácidos que serán inmunógenos cuando se Inyectan a un paciente humano. Numerosos estudios han demostrado que, después de la inyección de un anticuerpo extraño, la respuesta ¡nmunitaria provocada por un paciente contra un anticuerpo puede ser muy fuerte, eliminando esencialmente la utilidad terapéutica del anticuerpo después de un tratamiento Inicial. Además, dado que puede esperarse que se desarrollen números crecientes de anticuerpos monoclonales diferentes de ratón u otros anticuerpos monoclonales antlgénlcos (para los seres humanos) para tratar diversas enfermedades, después de los tratamientos primero y segundo con cualesquiera anticuerpos no humanos diferentes, los tratamientos subsiguientes incluso para terapias no semejantes pueden ser Ineficaces o Incluso peligrosos en sí mismos.

SI bien la producción de los denominados "anticuerpos quiméricos" (p. ej., regiones variables de ratón unidas a reglones constantes humanas) (véase, por ejemplo, el documento WO89/09622) ha alcanzado un éxito relativo, persiste un problema Importante de ¡nmunogenlcldad. En general, la producción de inmunoglobulinas humanas reactivas con el receptor de IL-2 humana, como con muchos antígenos humanos, ha resultado extremadamente difícil utilizando técnicas de producción de anticuerpos monoclonales humanos típicas. Análogamente, los intentos pasados que utilizan tecnología de ADN recomblnante para producir los denominados anticuerpos "humanizados" (véase p. eL la publicación EPO N.°: 0239400), proporcionan resultados inciertos, debido en parte a afinidades de unión no predecibles.

Así pues, existe la necesidad de formas mejoradas de inmunoglobulinas análogas a las humanas, tales como las específicas para el receptor de IL-2 humana, que sean sustancialmente no inmunógenas en seres humanos, pero que se produzcan fácil y económicamente de una manera adecuada para formulación terapéutica y otros usos. La presente invención satisface estas y otras necesidades.

Las regiones hipervariables (denominadas también Regiones Determinantes de la Complementariedad, abreviado a "CDR") de las inmunoglobulinas fueron definidas originalmente por Kabat y col. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E., y col., Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, (1983)) sobre la base de la extensión de la variabilidad de secuencia, indicándose que están constituidas por los restos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera, (Vl) y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el domino variable de la cadena pesada (VH), utilizando el sistema de numeración estándar de Kabat para aminoácidos de anticuerpos. Se cree que las CDR se ponen en contacto con el antígeno diana de un anticuerpo y son fundamentalmente responsables de la fijación. Más recientemente, Chothia y col. (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)) han dado una definición alternativa de las regiones hipervariables afirmando que están constituidas por los restos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3) en Vl... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de producción de una ¡nmunoglobulina humanizada adecuada para una inmunotoxina, inmunotoxina en la que dicha ¡nmunoglobulina está químicamente unida a un agente citotóxico, en el que dicha ¡nmunoglobulina humanizada se une a un antígeno y tiene una región marco aceptora humana y regiones determinantes de complementariedad (CDR) de Kabat de una ¡nmunoglobulina donante, además en el que la producción de dicha ¡nmunoglobulina humanizada comprende sustituir al menos un aminoácido no CDR del marco de la cadena ligera de ¡nmunoglobulina donante por el aminoácido correspondiente en el marco aceptor, en una posición en la que:

(a) el aminoácido en el marco aceptor es raro para dicha posición y el aminoácido correspondiente en el marco donante es común para dicha posición en secuencias de ¡nmunoglobulina humana; o

(b) el aminoácido es inmediatamente adyacente a una de las CDR; o

(c) se predice que el aminoácido tiene un átomo de cadena lateral capaz de interaccionar con las CDR de la ¡nmunoglobulina humanizada.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la ¡nmunoglobulina humanizada tiene una afinidad de unión por el antígeno de 108 M'1 o mayor.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que dicha ¡nmunoglobulina humanizada es un tetrámero de anticuerpo compuesto por un par idéntico de polipéptidos de cadena pesada y un par idéntico de polipéptidos de cadena ligera.

4. El procedimiento según las reivindicaciones 1 a 3, en el que el agente citotóxico es una proteína, radionucleido o fármaco quimioterapéutico.

5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que el agente citotóxico es una proteína y en el que dicha proteína está químicamente unida a la ¡nmunoglobulina humanizada por la vía de un reticulador heterobifuncional, por ejemplo, SPDP, carbodiimida o aldehido glutárico.

6. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que el agente citotóxico es un radionucleido tal como yodo-131, itrio-90, renio-188 y bismuto-212.

7. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que el agente citotóxico es un fármaco quimioterapéutico tal como vindesina, metotrexato, adriamicina o cisplatino.

8. El procedimiento según las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha ¡nmunoglobulina donante es una ¡nmunoglobulina de ratón.

9. El procedimiento según las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha ¡nmunoglobulina humanizada tiene una región constante de cadena ligera codificada por un gen de región constante kappa o lambda.

10. El procedimiento según las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha ¡nmunoglobulina humanizada tiene una región constante de cadena pesada codificada por un gen de región constante alfa, gamma, delta, épsilon o mu.