Secuencias de nucleótidos de genes de palmitoil-ACP tioesterasa de canola y soja y su uso en la regulación del contenido de ácidos grasos de los aceites de las plantas de soja y canola.

Un fragmento de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una palmitoil-ACP tioesterasa de plantas en donde (i) dicha secuencia exhibe más de 90% de identidad global con la secuencia de DNA que codifica la proteína funcional madura codificada por los nucleótidos 506 a 1477 de SEQ ID NO:

1 y en donde (ii) dicha tioesterasa codificada cataliza la hidrólisis de palmitoil-, estearoil- y oleoil-ACP tioésteres, con escisión hidrolítica del enlace tioéster carbono-azufre en el grupo prostético pantoteno de la proteína portadora de palmitoil-acilo como su reacción preferida.

Secuencias de nucleótidos de genes de palmitoil-ACP tioesterasa de cañóla y soja y su uso en la regulación del contenido de ácidos grasos de los aceites de las plantas de soja y canda

Campo de la invención

La invención se refiere a la preparación y uso de fragmentos de ácido nucleico que codifican enzimas de plantas de palmitoil-ACP tioesterasa que modifican la composición de lípidos de las plantas. Genes quiméricos que incorporan tales fragmentos de ácido nucleico y secuencias reguladoras adecuadas pueden utilizarse para crear plantas transgénicas con niveles alterados de ácidos grasos saturados.

Antecedentes de la invención

Los lípidos de las plantas tienen una diversidad de usos industriales y nutrlclonales y son fundamentales para la función de la membrana de las plantas y la adaptación al clima. Estos lípidos representan un vasto conjunto de estructuras químicas, y estas estructuras determinan las propiedades fisiológicas e industriales del lípido. Muchas de estas estructuras son resultado directo o Indirecto de procesos metabólicos que alteran el grado de saturación del lípido.

Los lípidos de las plantas encuentran su uso principal como aceites comestibles en la forma de triacilgliceroles. La eficiencia específica y las cualidades sanitarias de los aceites comestibles están determinadas en gran parte por su composición de ácidos grasos. La mayoría de los aceites de plantas derivados de variedades comerciales de plantas se componen fundamentalmente de los ácidos palmítico (16:), esteárico (18:), oleico (18:1), linoleico (18:2) y linolénlco (18:3). Los ácidos palmítico y esteárico son, respectivamente, ácidos grasos saturados de 16 y 18

carbonos de longitud. Los ácidos oleico, linoleico, y linolénico son ácidos grasos insaturados de 18 carbonos de longitud que contienen uno, dos, y tres enlaces dobles, respectivamente. Al ácido oleico se hace referencia como ácido graso monoinsaturado, mientras que a los ácidos linoleico y linolénico se hace referencia como ácidos grasos polünsaturados. Las cantidades relativas de ácidos grasos saturados e insaturados en los aceites comestibles de plantas utilizados comúnmente se resumen a continuación (Tabla 1):

Tabla 1

Porcentajes de Ácidos Grasos Saturados e Insaturados en los Aceites de Cosechas Oleaginosas Seleccionadas

Muchos esfuerzos de investigación recientes han examinado el papel que juegan los ácidos grasos saturados e insaturados juegan en la reducción del riesgo de enfermedad cardiaca coronaria. En el pasado, se creía que los mono-insaturados, en contraste con los saturados y polünsaturados, no tenían efecto alguno sobre el colesterol en

suero y el riesgo de enfermedad cardiaca coronaria. Varios estudios clínicos recientes en humanos sugieren que las dietas ricas en grasa mono-insaturada y bajas en grasa saturada pueden reducir el colesterol "malo" (lipoproteína de baja densidad) mientras que mantienen el colesterol "bueno" (lipoproteína de alta densidad) (Mattson et al., Journal of Lipid Research (1985) 26:194-22). El aceite de soja es rico en ácidos grasos saturados cuando se compara con otras fuentes de aceite de plantas y contiene una proporción baja de ácido oleico, con relación al contenido total de

ácido graso de la semilla de soja. Estas características no cumplen necesidades sanitarias importantes como se definen por la American Heart Assoclaton.

Un aceite de soja pobre en saturados y polünsaturados totales y rico en monoinsaturados proporcionaría beneficios importantes para la salud a la población de los Estados Unidos, así como beneficio económico para los productores de aceite.

La biosíntesis de aceites en las plantas ha sido bastante bien estudiada [véase Harwood (1989) en Crltlcal Revlews in Plant Sciences, vol. 8 (1): 1 -43]. La biosíntesis de los ácidos palmítico, esteárico y oleico ocurre en los plastos por la interacción de tres enzimas fundamentales de la "vía ACP": palmitoil-ACP elongasa, estearoil-ACP desaturasa y las acil-ACP tioesterasas.

De estos tres tipos de enzima, las acil-ACP tioesterasas actúan para separar la cadena acilo de la proteína portadora (ACP) y por tanto del camino metabólico. La oleoil-ACP tioesterasa cataliza la hidrólisis de los oleoil-ACP tioésteres a velocidades altas y a velocidades mucho menores la hidrólisis de palmitoil-ACP y estearoil-ACP. Esta actividad múltiple conduce a competición de sustratos entre las enzimas y es la competición de esta acil-ACP tioesterasa y palmitoil-ACP elongasa para el mismo sustrato y de acil-ACP tioesterasa y estearoil-ACP desaturasa para el mismo sustrato lo que conduce a una porción de la producción de los ácidos palmítico y esteárico encontrados en el triaciiglicérido de los aceites de plantas.

Una vez separados de la pista de ACP, los ácidos grasos son exportados al citoplasma y se utilizan en éste para sintetizar la acil-coenzima A. Estas acil-CoA's son los donantes de acilo para al menos tres enzimas acilantes de glicerol diferentes (glicerol-3-P aciltransferasa, 1 -acil-glicerol-3-P aciltransferasa y diacilglicerol-aciltransferasa, que incorporan los restos acilo en los triacilglicéridos durante la biosíntesis de los aceites.

Estas aciltransferasas exhiben una preferencia acusada, pero no absoluta, para la incorporación de ácidos grasos saturados en las posiciones 1 y 3 y de ácidos grasos monoinsaturados en la posición 2 del triglicérido. Así, la alteración de la composición de ácidos grasos de la reserva de acilo impulsará por acción de paso un cambio correspondiente en la composición de ácidos grasos del aceite.

Basándose en la exposición anterior, un método para alteración de los niveles de los ácidos palmítico, esteárico y oleico en los aceites de plantas consiste en la alteración de sus niveles en la reserva citoplásmica de acil-CoA utilizada para la biosíntesis de los aceites.

Métodos para modulación del contenido de ácidos grasos en aceites de plantas se conocen por Blochemlstry and Molecular Biology of Membrane Storage Lipids of Plants, N. Murata y C.R. Somerville, Eds (Rockvllle, MD: The American Society of Plant Physiologists), 1993, páginas 6-66, Yadav et al., "Genetic manlpulatlon to alter fatty acld profiles of oilseed crops". En un trabajo previo (WO 9.211.373) la Solicitante ha demostrado que la oleoil-ACP tioesterasa puede modularse utilizando cDNA clonado que codifica la enzima de soja. Se utilizó cDNA de oleoil-ACP tioesterasa para formar genes quiméricos para la transformación de células de la planta de soja dando como resultado la inhibición antisentido de acil-ACP tioesterasa en la semilla de la planta. El cDNA codificante de la enzima de Brassica napus ha sido clonado también (Tópfer et al., J Plant Physiol. 143:416-425 (1994).

La Solicitante ha descubierto ahora una tioesterasa de plantas totalmente nueva con actividad sobre un sustrato C16 que es útil también para la regulación de la reserva de acil-coenzima A. La Solicitante ha aislado fragmentos de ácido nucleico que codifican palmitoil-ACP tioesterasas de soja y cañóla que son útiles en la modificación de la composición de ácidos grasos en especies productoras de aceite por transformación genética. Acil-tioesterasas de plantas que tienen actividad sobre sustratos de palmitoil-ACP se dan a conocer en WO 95/1339. Así, la transferencia de los fragmentos de ácido nucleico de la invención o una parte de los mismos que codifica una enzima funcional, junto con secuencias reguladoras adecuadas que dirigen la transcripción de su mRNA a una célula viva dará como resultado la producción o super-producción de palmitoil-ACP tioesterasas y conducirá a niveles incrementados de ácidos grasos saturados en los lípidos celulares, con inclusión de triacilgliceroles.

La transferencia de los fragmentos de ácido nucleico de la invención o una parte de... [Seguir leyendo]

1. Un fragmento de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una palmitoil-ACP tioesterasa de plantas en donde (i) dicha secuencia exhibe más de 9% de identidad global con la secuencia de DNA que codifica la proteína funcional madura codificada por los nucleótidos 56 a 1477 de SEQ ID NO: 1 y en donde (ii) dicha tioesterasa codificada cataliza la hidrólisis de palmitoil-, estearoil- y oleoll-ACP tioésteres, con escisión hidrolítica del enlace tioéster carbono-azufre en el grupo prostético pantoteno de la proteína portadora de palmltoil-acilo como su reacción preferida.

2. Un fragmento de ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde dicha secuencia de nucleótidos se define por los nucleótidos 1 a 1688 de SEQ ID NO: 1 y codifica la palmitoil-ACP tioesterasa de la semilla de soja.

3. Un fragmento de ácido nucleico aislado de la reivindicación 1 ó 2, en donde dicha secuencia de nucleótidos está definida por los nucleótidos 56 a 1477 de SEQ ID NO: 1 y codifica la palmitoil-ACP tioesterasa de la semilla de soja catalíticamente activa.

4. Un gen quimérico capaz de transformar una célula de planta de una especie productora de aceite que comprende el fragmento de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 enlazado operativamente a secuencias reguladoras adecuadas, en orientación antisentido, que producen inhibición antisentido de la palmitoil- ACP tioesterasa de semillas, en donde dicha inhibición da como resultado niveles inferiores de ácidos grasos saturados.

5. Un gen quimérico capaz de transformar una célula de planta de una especie productora de aceite que comprende el fragmento de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 enlazado operativamente a secuencias reguladoras adecuadas, en orientación de sentido, produciendo elevación de sentido o cosupresión de la palmitoil-ACP tioesterasa de semillas en donde dicha inhibición da como resultado niveles inferiores de ácidos grasos saturados.

6. Un gen quimérico de la reivindicación 4 en donde dicho fragmento de ácido nucleico es el fragmento de ácido nucleico de la reivindicación 2, enlazado operativamente a una secuencia reguladora adecuada, en orientación de sentido, produciendo inhibición antisentido de la palmitoil-ACP tioesterasa de semillas.

7. Un gen quimérico de la reivindicación 5 en donde dicho fragmento de ácido nucleico es el fragmento de ácido nucleico de la reivindicación 2, enlazado operativamente a una secuencia reguladora adecuada, en orientación de sentido, produciendo elevación de sentido o cosupresión de la palmitoil-ACP tioesterasa de semillas.

8. El gen quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 en donde dicha célula de planta de una especie productora de aceite se selecciona del grupo constituido por soja, colza, girasol, algodón, cacao, cacahuete, cártamo, y maíz.

9. Una célula de planta transformada con el gen quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.

1. La célula de planta, como se describe en la reivindicación 9, en donde la célula de planta se selecciona del grupo constituido por soja, colza, girasol, algodón, cacao, cacahuete, cártamo, y maíz.

11. Un método de producción de aceite de semillas de plantas que contiene niveles inferiores de los ácidos palmítico y esteárico, que comprende:

(a) transformar una célula de planta con un gen quimérico seleccionado de

(i) el gen quimérico de la reivindicación 4 ó 6,

(ii) un gen quimérico que comprende una parte de la secuencia de nucleótidos que codifica una palmitoil-ACP tioesterasa de plantas como se define en la reivindicación 1, 2 ó 3 para producir inhibición antisentido de la palmitoil-ACP tioesterasa de semillas, estando dicha parte enlazada operativamente a secuencias reguladoras adecuadas, en orientación antisentido.

(iii) un gen quimérico de la reivindicación 5 ó 7 en donde dicho gen quimérico produce cosupresión de palmitoil- ACP tioesterasa de semillas o

(iv) un gen quimérico que comprende una parte de la secuencia de nucleótidos que codifica una palmitoil-ACP tioesterasa de plantas como se define en la reivindicación 1, 2 ó 3 para producir cosupresión de la palmitoil- ACP tioesterasa de semillas, estando dicha parte enlazada operativamente a secuencias reguladoras adecuadas, en orientación de sentido,

(b) dejar crecer plantas fértiles a partir de dichas células de plantas transformadas,

(c) someter a cribado semillas de la progenie de dichas plantas fértiles respecto a los niveles deseados de ácidos palmítico y esteárico, y

(d) triturar dichas semillas de la progenie para obtener dicho aceite de semillas de la planta que contiene niveles inferiores de ácidos palmítico y esteárico.

12. Un método de producción de aceites a partir de semillas de plantas, que contienen niveles superiores de ácidos palmítico y esteárico, que comprende:

(a) transformar una célula de planta de una especie productora de aceite con un gen quimérico de la reivindicación 5

ó 7, en donde dicho gen quimérico produce aumento de la palmitoil-ACP tioesterasa de plantas,

(b) dejar crecer plantas fértiles y sexualmente maduras a partir de dichas células de plantas transformadas de una especie productora de aceite,

(c) someter a cribado semillas de la progenie de dichas plantas fértiles respecto a los niveles deseados de ácidos 1 palmítico y esteárico, y

(d) triturar dichas semillas de la progenie para obtener dicho aceite que contiene niveles superiores de los ácidos palmítico y esteárico.

13. El método de la reivindicación 11 en donde dicha planta es soja y dicho gen quimérico es el gen quimérico de la reivindicación 6.

14. El método de la reivindicación 12 en donde dicha planta es soja y dicho gen quimérico es el gen quimérico de

la reivindicación 7.

15. El método de la reivindicación 11 ó la reivindicación 12, en donde dicha célula de planta de una especie productora de aceite se selecciona del grupo constituido por soja, colza, girasol, algodón, cacao, cacahuete, cártamo, y maíz.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en donde dicho paso de transformación se

realiza por un proceso seleccionado del grupo constituido por infección con Agrobacterium, electroporación, y bombardeo balístico a alta velocidad.

17. Un fragmento de ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde dicha palmitoil-ACP tioesterasa de planta codificada es una acil-ACP tioesterasa conforme a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

18. Uso del fragmento de ácido nucleico de la reivindicación 1 o una parte de la secuencia de nucleótidos de la

reivindicación 1 y como se define en la reivindicación 11, para reducir el nivel de palmitoil-ACP tioesterasa en una planta transgénica que contiene un gen endógeno que tiene más de 9% de identidad global con la región codificante de dicho fragmento.