Procedimiento para la producción de inmunoglobulinas humanizadas.

El uso de primeras secuencias de nucleótidos que codifican regiones de marco de las cadenas ligera y pesada de Ig aceptora humana y de segundas secuencias de nucleótidos que codifican RDC de una Ig donante en la producción de polinucleótidos expresables que codifican una inmunoglobulina humanizada;

inmunoglobulina que es una obtenible por un procedimiento que comprende:

(a) comparar las secuencias de aminoácidos de la región de marco o variable de las cadenas ligera y pesada de Ig donante con secuencias correspondientes de una colección de cadenas de Ig humana;

(b) seleccionar, para proporcionar marcos de cadena ligera y pesada de Ig aceptora humana, secuencias de la colección que tienen al menos el 65 % de identidad con las secuencias de marco donantes respectivas; y

(c) combinar las RDC de la Ig donante y marcos de las secuencias aceptoras seleccionadas

Procedimiento para la producción de ¡nmunoglobulinas humanizadas Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a la combinación de tecnologías de ADN recombinante y anticuerpos monoclonales para desarrollar nuevos agentes terapéuticos y más particularmente, a la producción de anticuerpos no ¡nmunógenos y a sus usos.

Antecedentes de la invención

En los mamíferos, la respuesta ¡nmunltarla está mediada por dos tipos de células que ¡nteracclonan específicamente con material extraño, es decir, antígenos. Uno de estos tipos de células, las células B, es responsable de la producción de anticuerpos. La segunda clase de células, las células T, incluyen una gran diversidad de subconjuntos celulares que controlan la función in vivo tanto de las células B como de una gran diversidad de otras células hematopoyétlcas, Incluidas las células T.

Una manera en la que las células T ejercen este control es mediante la producción de una linfocina conocida como interleucina-2 (IL-2), denominada originalmente factor de crecimiento de las células T. La función primaria de IL-2 parece ser la estimulación y el mantenimiento de las células T. De hecho, algunos inmunólogos creen que IL-2 puede encontrarse en el centro de la respuesta ¡nmunltarla completa (véase, Farrar, J. y col., Immunol. Rev. 63: 129-166 (1982), que se Incorpora el presente documento por referencia).

Para ejercer sus efectos biológicos, IL-2 ¡nteracclona con un receptor de membrana específico de alta afinidad (Greene, W. y col., Proaress in Hematoloav XIV. E. Brown, compilador, Gruñe y Statton, Nueva York (1986), en las páginas 283 y siguientes). El receptor de IL-2 humana es una glucoproteína compleja de cadenas múltiples, teniendo una de las cadenas, conocida como el péptldo Tac, aproximadamente 55 kD de tamaño (véase, Leonard, W. y col., J. Biol. Chem.. 260: 1872 (1985), que se Incorpora en el presente documento mediante referencia). Se ha aislado un gen que codifica esta proteína y predice un péptldo de 272 aminoácidos, con inclusión de un péptido señal de 21 aminoácidos (véase. Leonard, W. y col., Nature 311: 626 (1984)). Los 219 aminoácidos NH2 terminales de la proteína p55 Tac comprenden aparentemente un dominio extracelular (véase. Leonard, W. y col., Science. 230: 633-639 (1985), que se incorpora el presente documento por referencia).

Gran parte de la dilucidación de la estructura y función del receptor de IL-2 humana y su función se debe al desarrollo de anticuerpos monoclonales específicamente reactivos. En particular, un anticuerpo monoclonal de ratón, conocido como antl-Tac (Uchiyama y col., J. Immunol. 126: 1393 (1981)) ha demostrado que se pueden detectar receptores de IL-2 en las células T, pero también en células de la familia monocitos-macrófagos, células Kupffer del hígado, células Langerhans de la piel y por supuesto, células T activadas. De forma importante, las células T inactivas, las células B o los macrófagos circulantes no presentan típicamente el receptor de IL-2 (Herrmann v col.. J. Exp. Med. 162: 1111 (1985)).

El anticuerpo monoclonal anti-Tac se ha utilizado también para definir funciones de los linfocitos que requieren interacción con IL-2 y se ha demostrado que inhibe diversas funciones de las células T, oncluyendo la generación de linfocitos T citotóxicos y supresores en la estructura de la célula. Asimismo, sobre la base de estudios con anti- Tac y otros anticuerpos, se asocian actualmente una diversidad de trastornos con la expresión impropia de receptor de IL-2 por las células T, en particular la leucemia de las células T de los adultos.

Más recientemente, el receptor de IL-2 ha mostrado ser una diana ideal para nuevos enfoques terapéuticos a las enfermedades mediadas por las células T. Se ha propuesto que anticuerpos específicos del receptor de IL-2, tales como el anticuerpo monoclonal anti-Tac, se pueden utilizar bien sea solos o bien como un inmunoconjugado (p e¡.. con Ricina A, isótopos y similares) para separar eficazmente las células que llevan el receptor de IL-2. Estos agentes pueden, por ejemplo, eliminar teóricamente las células leucémicas que expresan el receptor de IL-2, ciertas células B, o células T activadas implicadas en un estado de enfermedad, permitir aun la retención de las células T normales maduras y sus precursores para asegurar la capacidad de montar una respuesta inmunitaria de las células T normales en caso necesario. En general, la mayoría de otros agentes específicos de las células T pueden destruir esencialmente todas las células T periféricas, lo que limita la eficacia terapéutica de los agentes. Globalmente, el uso de anticuerpos monoclonales apropiados específicos para el receptor de IL-2 puede tener utilidad terapéutica en enfermedades autoinmunes, trasplantes de órganos y cualquier respuesta no deseada por las células T activadas. De hecho, se han iniciado pruebas clínicas utilizando, p ej., anticuerpos anti-Tac (véase, en general. Waldman, T. y col., Cáncer Res. 45: 625 (1985) y Waldman, T., Science 232: 727-732 (1986), ambos incorporados en el presente documento por referencia).

Desafortunadamente, el uso del anticuerpo anti-Tac y otros anticuerpos monoclonales no humanos presenta

ciertos inconvenientes, en particular en regímenes terapéuticos repetidos como se explica más adelante. Los anticuerpos monoclonales de ratón, por ejemplo, no fijan bien el complemento humano y carecen de otras características funcionales importantes de inmunoglobulinas cuando se utilizan en seres humanos.

Quizás de manera más importante, el anticuerpo anti-Tac y otros anticuerpos monoclonales no humanos contienen tramos sustanciales de secuencias de aminoácidos que serán inmunógenos cuando se inyectan a un paciente humano. Numerosos estudios han demostrado que, después de la inyección de un anticuerpo extraño, la respuesta inmunitaria provocada por un paciente contra un anticuerpo puede ser muy fuerte, eliminando esencialmente la utilidad terapéutica del anticuerpo después de un tratamiento inicial. Además, dado que puede esperarse que se desarrollen números crecientes de anticuerpos monoclonales diferentes de ratón u otros anticuerpos monocloneles antigénicos (para los seres humanos) para tratar diversas enfermedades, después de los tratamientos primero y segundo con cualesquiera anticuerpos no humanos diferentes, los tratamientos subsiguientes incluso para terapias no semejantes pueden ser ineficaces o incluso peligrosos en sí mismos.

Si bien la producción de los denominados "anticuerpos quiméricos" (p ej., regiones variables de ratón unidas a regiones constantes humanas) (véase, por ejemplo, el documento WO89/09622) ha alcanzado un éxito relativo, persiste un problema importante de inmunogenicidad. En general, la producción de inmunoglobulinas humanas reactivas con el receptor de IL-2 humana, como con muchos antígenos humanos, ha resultado extremadamente difícil utilizando técnicas de producción de anticuerpos monoclonales humanos típicas. Análogamente, los intentos pasados que utilizan tecnología de ADN recombinante para producir los denominados anticuerpos "humanizados" (véase p ei.. la publicación EPO N.°: 0239400), proporcionan resultados inciertos, debido en parte a afinidades de unión no predecibles.

Así pues, existe necesidad de formas mejoradas de inmunoglobulinas análogas a las humanas, tales como las específicas para el receptor de IL-2 humana, que sean sustancialmente no inmunógenas en seres humanos, sin embargo se producen fácil y económicamente de una manera adecuada para formulación terapéutica y otros usos. La presente invención satisface estas y otras necesidades.

Rlechmann y col. ("Reshaplng human antlbodles fortherapy", Nature, vol. 332, páginas 323-326, (marzo de 1988)) describen un trabajo en el que precisamente las CDR de Kabat se transfirieron a un marco humano predeterminado (NEW de nuevo para la cadena pesada y REI para la cadena ligera). Sin embargo, dichos autores encontraron que un anticuerpo que contenía la cadena pesada humanizada perdía la mayor parte de su afinidad de unión y aptitud para Usar las células diana. Por esta razón, dichos Investigadores produjeron un nuevo anticuerpo humanizado que contenía las CDR de Kabat a partir del anticuerpo de ratón y dos cambios de aminoácidos en el bucle hlpervariable H1 de Chothia, pero ningún otro aminoácido de ratón.

Sumario de la invención

La Invención proporciona el uso de primeras secuencias nucleotídlcas que codifican para reglones marco de cadenas ligeras y pesadas de Ig aceptoras humanas y segundas secuencias nucleotídicas que codifican para CDR de Kabat de una Ig donante en la producción de polinucleótidos expresables que codifican... [Seguir leyendo]

1. El uso de primeras secuencias nucleotídicas que codifican para regiones marco de cadenas ligeras y pesadas de Ig aceptaras humanas y segundas secuencias nucleotídicas que codifican para CDR de Kabat de una Ig donante en la producción de polinucleótidos expresables que codifican una ¡nmunoglobulina humanizada, inmunoglobulina en la que:

(a) los marcos de las cadenas ligera y pesada de Ig aceptaras humanas son secuencias seleccionadas de un conjunto de cadenas de Ig humanas y tienen al menos un 65% de identidad con las respectivas secuencias marco donantes; y

(b) CDR de la Ig donante se combinan con marcos de las secuencias aceptaras seleccionadas.

2. El uso de primeras secuencias nucleotídicas que codifican para marcos de cadenas ligeras y pesadas de Ig aceptaras humanas y segundas secuencias nucleotídicas que codifican para CDR de Kabat de una Ig donante en la producción de una inmunoglobulina humanizada, inmunoglobulina en la que:

(a) los marcos de las cadenas ligeras y pesadas de Ig aceptara humana son secuencias seleccionadas de un conjunto de cadenas de Ig humanas y tienen al menos un 65% de Identidad con las respectivas secuencias marco donantes; y

(b) las CDR de la Ig donante se combinan con marcos de las secuencias aceptaras seleccionadas.

3. El uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la ¡nmunoglobulina humanizada tiene una afinidad por un antfgeno de al menos aproximadamente 108 M"1.

4. Un procedimiento para la producción de una inmunoglobulina humanizada, que comprende:

(a) comparar las secuencias de aminoácidos de la región marco o variable de las cadenas ligeras y pesadas de las Ig donantes con las correspondientes secuencias en un conjunto de cadenas de Ig humanas;

(b) seleccionar, para proporcionar marcos de las cadenas ligeras y pesadas de Ig aceptaras humanas, secuencias del conjunto que tiene al menos un 65% de Identidad con las respectivas secuencias marco donantes; y

(c) combinar CDR de Kabat de la Ig donante y marcos de las secuencias aceptaras seleccionadas, mediante el uso de primeras secuencias nucleotídicas que codifican las regiones marco de las cadenas ligeras y pesadas de las Ig aceptaras humanas y segundas secuencias nucleotídicas que codifican para las CDR de la Ig donante.

5. Un uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicha Ig donante es una Ig de ratón.

6 Un procedimiento de la reivindicación 4 o 5, en el que dicha inmunoglobulina humanizada es un tetrámero de anticuerpo compuesto por un par Idéntico de pollpéptldos de cadena pesada y un par Idéntico de polipéptidos de cadena ligera.

7. Un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que dicha inmunoglobulina humanizada tiene una región constante de la cadena ligera codificada por un gen de la reglón constante kappa.

8. Un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que dicha inmunoglobulina humanizada tiene una región constante de la cadena pesada codificada por un gen de la región constante gamma.