Interferencia de RNA mediadora de moléculas pequeñas de RNA.

Uso de un método in vitro de mediación de la interferencia de RNA específica de la diana en una célula eucariota que comprende los pasos:

a) poner en contacto dicha célula eucariota con una molécula de RNA bicatenario aislada, en donde cada cadena de RNA tiene una longitud de 19-23 nucleótidos, en donde dicha molécula de RNA es capaz de interferencia de RNA específica de la diana, en donde al menos una cadena tiene un colgante 3’ de 1-3 nucleótidos y en donde la molécula de RNA contiene al menos un análogo de nucleótido modificado, en condiciones en las cuales puede ocurrir la interferencia de RNA específica de la diana, y

b) mediar una interferencia de RNA específica de la diana efectuada por el RNA bicatenario hacia un ácido nucleico diana que tiene una porción de secuencia que corresponde sustancialmente al RNA bicatenario, para modulación de la función de un gen en una célula eucariota, en donde el gen está asociado con una afección patológica, y en donde el gen es adicionalmente un gen asociado a un patógeno, un gen asociado a un tumor o un gen asociado a una enfermedad autoinmune.

Interferencia de RNA mediadora de moléculas pequeñas de RNA.

La presente invención se refiere a características de secuencia y estructurales de moléculas de (ds) RNA bicatenario requeridas para mediar modificaciones de ácido nucleico específicas de la diana tales como la interferencia de RNA 5 y/o metilación del DNA.

La expresión “Interferencia de RNA” (RNAi) fue acuñada después del descubrimiento de que la inyección de dsRNA en el nematodo C. elegans conduce a silenciación específica de genes altamente homólogos en secuencia al dsRNA administrado (Fire et al., 1998) . La RNAi fue observada también posteriormente en insectos, ranas (Oelgeschlager et al., 2000) , y otros animales con inclusión de ratones (Svoboda et al., 2000; Wianny y Zernicka-Goetz, 10 2000) y es probable que exista también en humanos. La RNAi está estrechamente ligada al mecanismo de cosupresión postranscripcional de silenciación de genes (PTGS) en plantas y destrucción en hongos (Catalanotto et al., 2000; Cogoni y Macino, 1999; Dalmay et al., 2000; Ketting y Plasterk, 2000; Mourrain et al., 2000; Smardon et al., 2000) y algunos componentes de la maquinaria de la RNAi son necesarios también para silenciación postranscripcional por co-supresión (Catalanotto et al., 2000; Dernburg et al., 2000; Ketting y Plasterk, 2000) . El tema ha sido revisado también recientemente (Bass, 2000; Bosher y Labouesse, 2000; Fire, 1999; Plasterk y Ketting, 2000; Sharp, 1999; Sijen y Kooter, 2000) , véase también el número completo de Plant Molecular Biology, vol. 43, número 2/3, (2000) .

En las plantas, además de PTGS, los transgenes introducidos pueden conducir también a silenciación transcripcional de genes por metilación del DNA de citosinas dirigida por RNA (véanse referencias en Wassenegger,

2000) . Dianas genómicas tan cortas como 30 pb están metiladas en plantas de manera dirigida por RNA (Pelissier, 2000) . La metilación del DNA está presente también en mamíferos.

La función natural de RNAi y la co-supresión parece ser la protección del genoma contra la invasión por elementos genéticos móviles tales como retrotransposones y virus que producen RNA o dsRNA aberrante en la célula hospedadora cuando se vuelven activos (Jensen et al., 1999; Ketting et al., 1999; Ratcliff et al., 1999; Tabara et al.,

1999) . La degradación específica del mRNA evita la replicación de transposones y virus, aunque algunos virus son capaces de contrarrestar o prevenir este proceso por expresión de proteínas que suprimen la PTGS (Lucy et al., 2000; Voinnet et al., 2000) .

El dsRNA desencadena la degradación específica de RNAs homólogos únicamente dentro de la región de identidad con el dsRNA (Zamore et al., 2000) . El dsRNA se procesa a fragmentos de RNA de 21-23 nt y los sitios de escisión 30 del RNA diana están distanciados regularmente con una separación de 21-23 nt. Por esta razón, se ha sugerido que los fragmentos de 21-23 nt son los RNAs guía para reconocimiento de la diana (Zamore et al., 2000) . Estos RNAs cortos fueron detectados también en extractos preparados a partir de células Schneider 2 de D. melanogaster que se transfectaron con dsRNA antes de la lisis celular (Hammond et al., 2000) ; sin embargo, las fracciones que exhibían actividad de nucleasa específica de la secuencia contenían también una gran fracción de dsRNA residual.

El papel de los fragmentos de 21-23 nt en el guiamiento de la escisión de mRNA se ve respaldado adicionalmente por la observación de que fragmentos de 21-23 nt aislados de dsRNA procesado son capaces, en cierto grado, de mediar la degradación específica de mRNA (Zamore et al., 2000) . Moléculas de RNA de tamaño similar se acumulan también en tejido vegetal que exhibe PTGS (Hamilton y Baulcombe, 1999) .

En este caso, los autores de la presente invención utilizan el sistema establecido de Drosophila in vitro (Tuschl et al.,

1999; Zamore et al., 2000) para explorar adicionalmente el mecanismo de la RNAi. Se demuestra aquí que RNAs cortos de 21 y 22 nt, cuando están apareados en bases con extremos 3’ colgantes, actúan como los RNAs guía para degradación del mRNA específica de la secuencia. Los dsRNAs cortos de 30 pb son incapaces de mediar la RNAi en este sistema debido a que ya no se procesan a RNAs de 21 y 22 nt. Adicionalmente, se han definido los sitios de escisión de RNA diana con relación a los RNAs de interferencia cortos de 21 y 22 nt (siRNAs) y se aporta evidencia 45 de que la dirección de procesamiento del dsRNA determina si un RNA diana sentido o antisentido puede ser escindido por el complejo siRNA-endonucleasa producido. Adicionalmente, los siRNAs pueden ser también instrumentos importantes para modulación de la transcripción, v.g. silenciación de genes de mamífero por guiamiento de la metilación del DNA.

Experimentos adicionales en sistemas de cultivo de células humanas in vivo (células HeLa) demuestran que 50 moléculas de RNA bicatenario que tienen preferiblemente una longitud de 19-25 nucleótidos tienen actividad de RNAi. Así, en contraste con los resultados de Drosophila, también moléculas de RNA bicatenario de 24 y 25 nt de longitud son eficientes para la RNAi.

El objeto subyacente de la presente invención es proporcionar nuevos agentes capaces de mediar la Interferencia de RNA específica de la diana u otras modificaciones de ácido nucleico específicas de la diana tales como 55 metilación del DNA, teniendo dichos agentes eficacia y seguridad mejoradas comparados con agentes de la técnica anterior.

La solución de este problema se proporciona por el uso de un método in vitro de mediación de la interferencia de RNA específica de la diana en una célula eucariota que comprende los pasos:

a) poner en contacto dicha célula eucariota con una molécula de RNA bicatenario aislada, en donde cada cadena de RNA tiene una longitud de 19-23 nucleótidos, en donde dicha molécula de RNA es capaz de interferencia de RNA

específica de la diana en condiciones en las cuales puede ocurrir la interferencia de RNA específica de la diana, y

b) mediar una interferencia de RNA específica de la diana efectuada por el RNA bicatenario hacia un ácido nucleico diana que tiene una porción de secuencia que corresponde sustancialmente al RNA bicatenario,

para modular la función de un gen de una célula eucariota, en donde el gen está asociado con una afección patológica, y en donde el gen es adicionalmente un gen asociado a un patógeno, un gen asociado a un tumor o un gen asociado a una enfermedad autoinmune. Al menos una cadena tiene un colgante 3’ de 1-3 nucleótidos y

preferiblemente 2 nucleótidos. La otra cadena puede tener extremos romos o tiene un colgante 3’ de hasta 6

nucleótidos. La molécula de RNA es preferiblemente una molécula de RNA sintética que está sustancialmente exenta de contaminantes existentes en extractos de células, v.g. de embriones de Drosophila. Adicionalmente, la molécula de RNA está con preferencia sustancialmente exenta de cualesquiera contaminantes no específicos de la diana, particularmente moléculas de RNA no específicas de la diana, v.g., de contaminantes existentes en extractos de células. La molécula de RNA contiene al menos un análogo de nucleótido modificado.

Sorprendentemente, se encontró que moléculas de RNA bicatenario sintético corto, particularmente con extremos 3’ colgantes son mediadores específicos de secuencia de RNAi y median la escisión eficiente del RNA diana, en donde el sitio de escisión está localizado cerca del centro de la región abarcada por el RNA guía corto.

Preferiblemente, cada cadena de la molécula de RNA tiene una longitud de 20-22 nucleótidos (o 20-25 nucleótidos en células de mamífero) , en donde la longitud de cada cadena puede ser igual o diferente. La longitud del colgante 3’ alcanza de 1 a 3 nucleótidos, en donde la longitud del colgante puede ser igual o diferente para cada cadena. Las cadenas de RNA tienen preferiblemente grupos hidroxilo 3’. El término 5’ comprende preferiblemente un grupo fosfato, difosfato, trifosfato o hidroxilo. Los dsRNAs más eficaces están compuestos de dos cadenas de 21 nt que se aparean de tal modo que están presentes colgantes 3’ de 1-3, particularmente 2 nt en ambos extremos del dsRNA.

La reacción de escisión del RNA diana guiada por siRNAs es altamente específica de la secuencia. Sin embargo, no todas las posiciones de un siRNA contribuyen por igual al reconocimiento de la diana. Los desapareamientos en el centro del dúplex de siRNA son sumamente críticos y anulan esencialmente la escisión del RNA diana. En contraste, el nucleótido 3’ de la cadena de siRNA... [Seguir leyendo]

1. Uso de un método in vitro de mediación de la interferencia de RNA específica de la diana en una célula eucariota que comprende los pasos:

a) poner en contacto dicha célula eucariota con una molécula de RNA bicatenario aislada, en donde cada cadena de RNA tiene una longitud de 19-23 nucleótidos, en donde dicha molécula de RNA es capaz de interferencia de RNA específica de la diana, en donde al menos una cadena tiene un colgante 3’ de 1-3 nucleótidos y en donde la molécula de RNA contiene al menos un análogo de nucleótido modificado, en condiciones en las cuales puede ocurrir la interferencia de RNA específica de la diana, y

b) mediar una interferencia de RNA específica de la diana efectuada por el RNA bicatenario hacia un ácido nucleico diana que tiene una porción de secuencia que corresponde sustancialmente al RNA bicatenario, para modulación de la función de un gen en una célula eucariota, en donde el gen está asociado con una afección patológica, y en donde el gen es adicionalmente un gen asociado a un patógeno, un gen asociado a un tumor o un gen asociado a una enfermedad autoinmune.

2. El uso de la reivindicación 1, en donde cada cadena de la molécula de RNA bicatenario tiene una longitud d.

2. 22 nucleótidos.

3. El uso de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el colgante 3’ está estabilizado contra la degradación. 20

4. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el análogo de nucleótido modificado se selecciona de ribonucleótidos modificados en el azúcar o en la cadena principal.

5. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el análogo de nucleótido es un ribonucleótido

modificado en el azúcar, en donde el grupo 2’-OH está reemplazado por un grupo seleccionado de H, OR, R, halo, SH, SR1, NH2, NHR, NR2 o CN, en donde R es C1-C6 alquilo, alquenilo o alquinilo y halo es F, Cl, Br o l.

6. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el análogo de nucleótido es un oligonucleótido modificado en la cadena principal que contiene un grupo fosforoditioato. 30

7. El uso de la reivindicación 6, en donde el gen asociado a un patógeno es un gen viral.

FIGURA 1A

Pp–luc/Rr–luc normalizada

FIGURA 2

pb tiempo (h)

diana sentido diana antisentido

FIGURA 3A

FIGURA 3B

diana sentido diana antisentido

FIGURA 4A

pb

pb

111 pb

FIGURA 4B

FIGURA 5A

pb

FIGURA 6A

Pp–luc/Rr–luc norm. Pp–luc/Rr–luc norm. Pp–luc/Rr–luc norm. Pp–luc/Rr–luc norm. Pp–luc/Rr–luc norm.

Rr–luc (u.a.) Pp–luc (u.a.)

Pp–luc/Rr–luc norm.

Fig. 11 Parte III

FIGURA 13

FIGURA 16

FIGURA 18

Pp–luc/Rr–luc norm.

FIGURA 19

Pp–luc/Rr–luc norm.

longitud (nt)

colgante 3’

Mosca Mosca (in vitro) (in vitro)

Pp–luc/Rr–luc norm.

longitud (nt) colgante 3’