Glicoproteína hialuronidasa soluble (sHASEGP), proceso para prepararla, usos y composiciones farmacéuticas que la comprenden.

Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de hialuronidasa truncado en el extremo C terminal,

donde el polipéptido codificado consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 98 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta como los aminoácidos 1-448 de SEC ID Nº: 4.

Glicoproteína hialuronidasa soluble (shasegp) , proceso para prepararla, usos y composiciones farmacéuticas que la comprenden Antecedentes de la invención Campo de la invención La presente invención se describe en las reivindicaciones y se refiere en general a glicoproteínas hialuronidasa solubles activas a pH neutro (sHASEGP) , porciones de las mismas, particularmente dominios hialuronidasa. La memoria describe modificaciones químicas, composiciones farmacéuticas, plásmidos de expresión, métodos para la fabricación y métodos terapéuticos que usan las glicoproteínas hialuronidasas y dominios de las mismas y las moléculas de ácido nucleico codificantes para la modificación terapéutica de glicosaminoglicanos en el tratamiento de una enfermedad y para el uso para aumentar la difusión de otras moléculas inyectadas de menos de 200 nanómetros de diámetro en un animal.

Información anterior

Los glicosaminoglicanos (GAG) son polisacáridos lineales complejos de la matriz extracelular (ECM) . Los GAG se caracterizan por estructuras disacáridas repetidas de una hexosamina N-sustituida y un ácido urónico, [hialuronano (HA) , sulfato de condroitina (CS) , condroitina (C) , sulfato de dermatán (DS) , sulfato de heparán (HS) , heparina (H) ],

o una galactosa, [sulfato de queratán (KS) ]. Excepto por el HA, todos se presentan unidos covalentemente a proteínas de núcleo. Los GAG con sus proteínas de núcleo se denominan estructuralmente proteoglicanos (PG) . El hialuronano (HA) se encuentra en mamíferos predominantemente en tejidos conjuntivos, piel, cartílago y en líquido sinovial. El hialuronano también es el constituyente principal del humor vítreo del ojo. En el tejido conjuntivo, el agua de hidratación asociada con el hialuronano genera espacios entre tejidos, generando de este modo un entorno que conduce a movimiento y proliferación celular. El hialuronano desempeña un papel clave en fenómenos biológicos asociados con la motilidad celular incluyendo el desarrollo rápido, regeneración, reparación, embriogénesis, desarrollo embrionario, cicatrización de heridas, angiogénesis y oncogénesis (Toole 1991 Cell Bioll Extracell. Matrix, Hay (ed.) , Plenum Press, Nueva York, 1384-1386; Bertrand et al. 1992 Int. J. Cancer 52: 1-6; Knudson et al, 1993 FASEB J. 7: 1233-1241) . Además, los niveles de hialuronano se correlacionan con la agresividad tumoral (Ozello et al. 1960 Cancer Res. 20: 600-604; Takeuchi et al. 1976, Cancer Res. 36: 2133-2139; Kimata et al. 1983 Cáncer Res.43: 1347-1354) .

El HA se encuentra en la matriz extracelular de muchas células, especialmente en tejidos conjuntivos blandos. Al HA se le han asignado diversas funciones fisiológicas, tales como en la homeostasis del agua y de proteínas plasmáticas (Laurent TC et al (1992) FASEB J 6: 2397-2404) . La producción de HA aumenta en células en proliferación y puede desempeñar un papel en la mitosis. También se ha implicado en la locomoción y en la migración celular. El HA parece desempeñar papeles importantes en la regulación, desarrollo y diferenciación celular (Laurent et al, anteriormente) .

El HA se ha usado en la medicina clínica. Su propiedades reológicas y protectoras de tejidos han demostrado utilidad en la cirugía oftálmica para proteger el endotelio corneal durante la cirugía de cataratas. El HA sérico es diagnóstico de enfermedad hepática y diversas afecciones inflamatorias, tales como artritis re6umatoide. El edema intersticial causado por acumulación de HA puede causar disfunción en diversos órganos (Laurent et al, anteriormente) .

Las interacciones proteicas del hialuronano también están implicadas en la estructura de la matriz extracelular o “sustancia fundamental”.

Las hialuronidasas son un grupo de enzimas activas a pH neutro y a pH ácido que se encuentran por todo el reino animal. Las hialuronidasas varían con respecto a la especificidad de sustrato y mecanismo de acción.

Existen tres clases generales de hialuronidasas:

1. Hialuronidasas de tipo mamífero, (EC 3.2.1.35) que son endo-beta-N-acetilhexosaminidasas con tetrasacáridos y hexasacáridos como los productos finales principales. Tienen actividades tanto hidrolítica como transglicosidasa y pueden degradar el hialuronano y los sulfatos de condroitina (CS) , en concreto C4-S y C6 -S.

2. Las hialuronidasas bacterianas (EC 4.2.99.1) , degradan el hialuronano y en diversos grados CS y DS. Son endobeta-N-acetilhexosaminidasas que funcionan mediante una reacción de beta-eliminación que produce principalmente productos finales disacáridos.

3. Las hialuronidasas (EC 3.2.1.36) de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos son endo-beta-glucuronidasas que generan productos finales tetrasacáridos y hexasacáridos a través de la hidrólisis del enlace beta 1-3. Las hialuronidasas de mamífero pueden dividirse adicionalmente en dos grupos: enzimas activas a pH neutro y activas a pH ácido. Existen seis genes de tipo hialuronidasa en el genoma humano, HYAL1, HYAL2, HYAL3 HYAL4 HYALP1 y PH20/SPAM1. HYALP1 es un pseudogén y no se ha demostrado que HYAL3 posea actividad enzimática

hacia ningún sustrato conocido. HYAL4 es una condroitinasa y carece de actividad hacia hialuronano. HYAL1 es la enzima activa a pH ácido prototípica y PH20 es la enzima activa a pH neutro prototípica. Las hialuronidasas activas a pH ácido, tales como HYAL1 y HYAL2, carecen de actividad catalítica a pH neutro. Por ejemplo, la HYAL1 no tiene actividad catalítica in vitro sobre pH 4, 5 (Frost et al Anal Biochemistr y , 1997) . HYAL2 es una enzima activa a pH ácido con una actividad específica muy baja in vitro.

Las enzimas de tipo hialuronidasa también pueden estar caracterizadas por las que están inmovilizadas en la membrana plasmática a través de un anclaje glicosilfosfatidilinositol tal como HYAL2 humana y PH20 humana (Danilkovitch-Miagkova, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 15 de abril de 2003; 100 (8) : 4580-5, Phelps et al., Science 1988) y las que son solubles, tales como HYAL1 humana (Frost et al, Biochem Biophys Res Commun. 9 de julio de 1997; 236 (1) : 10-5) . Sin embargo, existen variaciones entre especies: por ejemplo, la PH20 bovina se unen muy débilmente a la membrana plasmática y no se ancla mediante un anclaje sensible a fosfolipasa (Lalancette et al, Biol Reprod., agosto 2001; 65 (2) : 628-36.) . Esta característica única de la hialuronidasa bovina ha permitido el uso de la enzima hialuronidasa de testículos bovinos soluble como un extracto para uso clínico (Wydase, Hyalase) . Otras especies de PH20 son enzimas ancladas a lípidos que no son insolubles sin el uso de detergentes o lipasas. Por ejemplo, la PH20 humana se ancla a la membrana plasmática a través de un anclaje GPI. Los intentos para preparar construcciones de ADN de PH20 humana que no introducirían un anclaje lipídico en el polipéptido dieron como resultado una enzima catalíticamente inactiva o una enzima insoluble (Arming et al Eur J Biochem. 1 de Agosto de 1997;247 (3) : 810-4) . La hialuronidasa de esperma de macaco de origen natural se encuentra en forma tanto soluble como unida a membrana. Mientras que la forma unida a membrana de 64 kDa posee actividad enzimática a pH 7, 0, la forma de 54 kDa sólo es activa a pH 4, 0 (Cherr et al, Dev Biol. 10 de abril de 1996; 175 (1) : 142-53) . Por lo tanto, las formas solubles de PH20 carecen con frecuencia de actividad enzimática en condiciones neutras. Gmachl et al., FEBS 336 (3) : 545-548 (1993) describe la expresión recombinante de la proteína PHZO de esperma humano, Lin et al., JCB 125: 1157-1163 (1994) , describe la expresión recombinante de una proteína de fusión PH-ZOkT3 de ratón y cynomolgus.

Las condroitinasas son enzimas que se encuentran por todo el reino animal. Estas enzimas degradan los glicosaminoglicanos a través de una reacción endoglicosidasa. Los ejemplos específicos de condroitinasas conocidas incluyen condroitinasa ABC (obtenida de Proteus vulgaris; Solicitud de Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 6-153947, T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi y S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523 (1968) , S. Suzuki, H. Saito, T. Yamagata, K. Anno, N. Seno, Y. Kawai, y T. Furuhashi, J. Biol. Chem., 243, 1543 (1968) ) , condroitinasa AC (obtenida de Flavobacterium heparinum; T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi y S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523 (1968) ) , condroitinasa AC II (obtenida de Arthrobacter aurescens; K. Hiyama y S. Okada, J. Biol. Chem., 250, 1824 (1975) , K. Hiyama y S. Okada, J. Biochem. (Tokyo) , 80, 1201 (1976) ) , hialuronidasa ACIII (obtenida de Flavobacterium sp. Hp102; Hirofumi Miyazono, Hiroshi Kikuchi, Keiichi Yoshida, Kiyoshi Morikawa y Kiyochika Tokuyasu, Seikagaku, 61, 1023 (1989) ) , condroitinasa B (obtenida... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de hialuronidasa truncado en el extremo C terminal, donde el polipéptido codificado consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 98 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta como los aminoácidos 1-448 de SEC ID Nº : 4.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, donde el polipéptido se produce por la expresión de la molécula de ácido nucleico en un sistema de expresión de mamíferos.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o reivindicación 2, donde el polipéptido se produce por la expresión de la molécula de ácido nucleico de una célula CHO.

4. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID Nº : 48.

5. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta como los nucleótido.

10. 1446 de SEC ID Nº : 6.

6. La molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia señal para la secreción del polipéptido codificado.

7. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6, donde la secuencia señal es un péptido líder de cadena kappa IgG.

8. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7, donde el péptido líder de cadena kappa IgG tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID Nº : 43.

9. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el vector codifica el polipéptido truncado.

10. Un vector de la reivindicación 9, que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID Nº : 51.

11. El vector de la reivindicación 9 o 10 que es un vector de expresión.

12. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 9-11 que es un vector eucariota.

13. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 9-11 que es un vector de Pichia, un vector de E. coli o un vector viral.

14. Una célula aislada, que comprende un vector de cualquiera de las reivindicaciones 9-13.

15. La célula de la reivindicación 14 que es una célula procariota o una célula eucariota.

16. La célula de la reivindicación 14 seleccionada de entre una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula vegetal, una célula de insecto y una célula de mamífero.

17. La célula de la reivindicación 14 que es una célula de ovario de hámster Chino (CHO) .

18. Un método para producir un polipéptido de hialuronidasa soluble sustancialmente purificado que comprende:

introducir una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 unida operativamente con un promotor o un vector de cualquiera de las reivindicaciones 9-13 en una célula que incorpora restos de azúcar ligados a N en el polipéptido; cultivar la célula en condiciones por las que un polipéptido codificado se expresa y secreta por la célula; y recuperar el polipéptido o los polipéptidos expresados.

19. El método de la reivindicación 18, donde la célula se selecciona de una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula de levadura y una célula vegetal.

20. El método de la reivindicación 18, donde la célula es una célula de ovario de hámster Chino (CHO) .

21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 18-20, donde las células se cultivan en presencia de Butirato Sódico 0, 1-1 mM en condiciones adecuadas para la producción del polipéptido.

22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 18-21, donde el método para recuperar el polipéptido o los polipéptidos expresados comprende:

poner en contacto los medios que contienen el polipéptido o los polipéptidos expresados en baja fuerza iónica con una resina de intercambio aniónico a pH neutro;

eluir el polipéptido con sal a aproximadamente 400 mM;

poner en contacto el polipéptido con una resina de cromatografía de interacción hidrófoba en presencia de sulfato de amonio a aproximadamente 0, 5 M;

poner en contacto el polipéptido en sulfato de amonio con resina de fenil boronato;

eluir el polipéptido con baja salinidad a pH neutro;

poner en contacto el polipéptido con una resina de Hidroxiapatita; y

eluir el polipéptido con Fosfato Sódico aproximadamente 100 mM, dando como resultado de este modo un 10 polipéptido que está sustancialmente purificado.