Clon infeccioso de ADNc del virus del Síndrome Reproductor y Respiratorio Porcino (SRRP) Norteamericano y usos del mismo.

Una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de ADN que codifica una molécula infecciosa de ARN en la que dicha secuencia de ADN es al menos un 85% idéntica a la secuencia SEC ID Nº 1.

Clon infeccioso de ADNc del virus del Síndrome Reproductor y Respiratorio Porcino (SRRP) Norteamericano y usos del mismo Campo de la Invención La presente invención pertenece al campo de la salud animal y se refiere a los clones de ADNc infecciosos de los ARN virus de polaridad positiva y la elaboración de vacunas, en particular, vacunas porcinas, utilizando tales clones de ADNc.

Antecedente de la Invención El síndrome reproductor y respiratorio porcino (SRRP) es una nueva enfermedad de porcina, descrita por primera vez en 1987 en Norteamérica y en 1990 en Europa. La enfermedad se ha diseminado desde entonces a Asia y afecta a la mayoría de los países del mundo con mayor producción de cerdos. Los síntomas primarios son problemas reproductivos en cerdas de cría y lechonas de reposición, que incluyen abortos a término, mortinatos y momificados, y camadas de lechones pequeños débiles que nacen virémicos y que a menudo no consiguen sobrevivir. Además, el síndrome se manifiesta así mismo como una enfermedad respiratoria en lechones que se disemina horizontalmente y que produce fiebre, letargia, respiración dificultosa, pérdida de apetito, crecimiento lento, y ocasionalmente muerte, a menudo asociada con otros patógenos respiratorios. La enfermedad además se puede transmitir a cerdas y lechonas de reposición a través del semen de verracos infectados, sea por monta natural o por inseminación artificial. Por estas y otras razones, se ha probado que el SRRP es una enfermedad difícil de controlar y por tanto una de las enfermedades más dañinas económicamente de la industria porcina.

El agente causal del SRRP es el virus SRRP, del que existen dos tipos genética y serológicamente distintos (Murtaugh, M.P. y col., 1995, Arch-Virol. 140, 1451-1460; Suarez, P. y col., 1996, Virus Research 42:159-165) . Se cree que los dos tipos entraron por primera vez en la población porcina independientemente, uno en Norteamérica y el otro en Europa, en los 80, a partir de reservorios biológicos desconocidos, posiblemente de origen roedor o aviar. El tipo europeo, representado por el prototipo “Virus Lelystad”, se aisló y secuenció en Holanda en 1991 (Terpstra,

C. y col., 1991, Vet. Quart. 13:131-136; Wensvoort, G. y col., 1991, Vet. Quart. 13:121-130; Wensvoort, G. y col., documento WO 92/213751992 (PCT/NL92/00096) , 1992; Meulenberg, J.J.M. y col., 1993, Virol. 192:62-72) .

Tanto el virus SRRP norteamericano como el virus SRRP europeo se clasifican dentro de la familia Arteriviridae, que también incluye el virus de la arteritis equina, virus elevador de la lactato deshidrogenasa, y el virus de la fiebre hemorrágica de los simios. A su vez, los arterivirus se sitúan dentro del orden Nidovirales, que también incluyen los coronavirus y los torovirus. Los nidovirus son virus de envoltura que tienen genomas que consisten en una cadena sencilla de ARN con polaridad positiva. El ARN genómico de un ARN virus catenario positivo cumple con el doble papel de almacenamiento y expresión de la información genética. En los nidovirus no hay ADN que esté implicado en la replicación o la transcripción. La reproducción del ARN genómico de los nidovirus es por tanto un proceso combinado de replicación genómica y transcripción en ARNm. Además, en los nidovirus algunas proteínas se traducen directamente del ARN genómico. La biología molecular de la familia Arteriviridae ha sido revisada recientemente por Snijder y Meulenberg (Snijder, E.J. y Meulenberg, J.J.M., 1998, Journal of General Virology 79:961-979) .

Las vacunas disponibles comercialmente en la actualidad contra el SRRP son o las convencionales de virus vivo modificado (cultivo celular, atenuadas) o las muertas convencionales (cultivos celulares de virus virulento inactivados) . Varias de estas vacunas se han criticado basándose en lo que concierne a su seguridad y/o eficacia. Por tanto es muy deseable el desarrollo de una segunda generación de vacunas SRRP, que se basen en adiciones específicas, supresiones, y otras modificaciones del genoma SRRP. Sin embargo, como los virus SRRP no disponen de ADN intermedios para su replicación, tales vacunas han tenido por tanto que esperar la construcción de clones del ADNc de longitud completa de los virus SRRP por manipulación mediante técnicas de biología molecular a nivel del ADN. Muy recientemente, se ha informado de un clon infeccioso de ADNc de longitud completa del virus SRRP europeo (Meulenberg, J.J.M. y col., 1998, mencionado anteriormente; Meulenberg, J.J.M. y col., 1988, J. Virol. 72, 380-387.) .

Las publicaciones precedentes, así como otras referencias tratadas a continuación en esta solicitud, se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.

Sumario de la Invención El objeto de la invención proporciona una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de ADN que codifica una molécula infecciosa de ARN en el que dicha secuencia de ADN es al menos un 85% idéntica a la secuencia SEC ID Nº 1.

El objeto de la invención proporciona además una molécula infecciosa de ARN aislada codificada por la molécula de polinucleótido aislada mencionada anteriormente, en la que la molécula infecciosa de ARN aislada codifica un virus SRRP norteamericano.

El objeto de la invención proporciona además la molécula de polinucleótido aislada mencionada anteriormente que codifica la molécula infecciosa de ARN en forma de un vector que es un plásmido.

El objeto de la invención proporciona además una célula huésped transfectada que comprende una secuencia de ADN que codifica una molécula infecciosa de ARN, en la que dicha secuencia de ADN es al menos un 85% idéntica a la secuencia SEC ID Nº 1.

El objeto de la invención proporciona además una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de ADN que codifica una molécula infecciosa de ARN que codifica un virus SRRP norteamericano que está modificado genéticamente de forma que carece de un epítopo antigénico detectable, en el que dicha secuencia de ADN es al menos un 85% idéntica a la secuencia SEC ID Nº 1 pero careciendo de una o más secuencias de ADN que codifiquen un epítopo antigénico detectable.

El objeto de la invención además proporciona un plásmido capaz de transfectar directamente una célula huésped adecuada y expresar un virus de los Nidovirales a partir de la célula huésped transfectada de esta manera, en el que el plásmido comprende a) una secuencia de ADN que codifica una molécula infecciosa de ARN que codifica un virus de los Nidovirales teniendo dicha secuencia de ADN una secuencia con al menos el 85% de identidad secuencial con la secuencia SEC ID Nº 1 y b) un promotor capaz de transcribir dicha molécula infecciosa de ARN en dicha célula huésped adecuada.

El objeto de la invención proporciona además un procedimiento para generar un virus de los Nidovirales, cuyo procedimiento comprende transfectar una célula huésped adecuada con un plásmido capaz de transfectar directamente una célula huésped adecuada y expresar un virus de los Nidovirales a partir de la célula huésped adecuada así transfectada, en el que el plásmido comprende a) una secuencia de ADN que codifica una molécula infecciosa de ARN que codifica un virus de los Nidovirales teniendo dicha secuencia de ADN una secuencia con al menos el 85% de identidad secuencial con la secuencia SEC ID Nº 1 y b) un promotor capaz de transcribir dicha molécula infecciosa de ARN en dicha célula huésped adecuada.

Una vacuna para proteger un mamífero o un ave de la infección por virus de los Nidovirales que comprende un virus de los Nidovirales modificado genéticamente generado como se describió anteriormente en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunoprotectora eficaz contra virus de los Nidovirales tipo silvestre en un mamífero o un ave vacunados con la misma, y un vehículo aceptable para su uso farmacéutico o veterinario.

Breve descripción de las Figuras FIGURA 1: Estrategia de clonación para una construcción de un clon de ADNc infeccioso de longitud completa del virus SRRP norteamericano, pT7P129A. Las puntas de flecha representan las secuencias de promotor T7. FIGURA 2: Viremia sérica después de la infección con P129A o virus SRRP recombinante rP129A-1. Determinado por el ensayo en placa sobre células MARC-145. El límite más bajo de detección es 5 ufp/ml (o 0, 7 en escala logarítmica) . FIGURA 3: Anticuerpo sérico contra el virus SRRP después de la infección con P129A o virus SRRP recombinante rP129A-1. Determinado por ensayo ELISA SRRP HerdChek (IDEXX (Westbrook, Maine, EEUU) ) .

Descripción detallada de la Invención La producción y manipulación de las moléculas de polinucleótidos aisladas descritas en... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de ADN que codifica una molécula infecciosa de ARN en la que dicha secuencia de ADN es al menos un 85% idéntica a la secuencia SEC ID Nº 1.

2. Una molécula infecciosa de ARN aislada codificada por una molécula de polinucleótido aislada de acuerdo con la 5 reivindicación 1, en que la molécula infecciosa de ARN codifica un virus SRRP norteamericano.

3. Una molécula de polinucleótido aislada de acuerdo con la reivindicación 1 en forma de plásmido.

4. Una célula huésped transfectada que comprende una secuencia de ADN que codifica una molécula infecciosa de ARN, en la que dicha secuencia de ADN es al menos un 85% idéntica a la SEC ID Nº 1.

5. Un plásmido capaz de transfectar directamente una célula huésped adecuada y expresar un virus de los

Nidovirales a partir de la célula huésped así transfectada, dicho plásmido comprende a) una secuencia de ADN que codifica una molécula infecciosa de ARN que codifica virus de los Nidovirales, teniendo dichas secuencias de ADN una secuencia con al menos un 85% de identidad secuencial con la secuencia SEC ID Nº 1 y b) un promotor capaz de transcribir dicha molécula infecciosa de ARN en dicha célula huésped adecuada.

6. Un procedimiento para generar un virus de los Nidovirales, en el que el procedimiento comprende transfectar una célula huésped adecuada con un plásmido de acuerdo con la reivindicación 5 y obtener virus generados por la célula huésped transfectada.

7. Una molécula de polinucleótido aislada que comprende una molécula de ADN que codifica una molécula infecciosa de ARN que codifica un virus SRRP norteamericano que está modificado genéticamente, de forma que carece de epítopo antigénico detectable, en la que dicha secuencia de ADN es al menos un 85% idéntica a la SEC

ID Nº 1 pero carece de una o más secuencias de ADN que codifican un epítopo detectable.