Bacterinas tratadas térmicamente y vacunas en emulsión preparadas a partir de tales bacterinas tratadas térmicamente.

Una bacterina de Leptospira tratada térmicamente para su uso en una vacuna en emulsión que comprende una suspensión de bacterias muertas que tienen una actividad de lipasa del 50 % o inferior a la actividad de lipasa de la bacterina antes del tratamiento térmico en la que el tratamiento térmico comprende calentar la bacterina que tiene actividad de lipasa a una temperatura de 60 a 70 ºC durante 5 a 10 horas.

Bacterinas tratadas térmicamente y vacunas en emulsión preparadas a partir de tales bacterinas tratadas térmicamente Campo de la invención La presente invención se refiere, en general, al campo de las vacunas y a procedimientos de estabilización de vacunas en emulsión. En particular, la presente invención se refiere a bacterinas tratadas térmicamente, a un procedimiento de producción de bacterinas tratadas térmicamente y a vacunas en emulsión preparadas a partir de tales bacterinas tratadas térmicamente.

Antecedentes de la invención La vacunación se usa cada vez más para combatir enfermedades infecciosas en animales. Los coadyuvantes se usan frecuentemente en vacunas debido a que pueden aumentar la respuesta inmunitaria humoral y/o celular a un antígeno. Las vacunas se formulan frecuentemente como emulsiones debido a que la emulsión puede actuar de coadyuvante y tiene la propiedad de retener el antígeno como un depósito en el sitio de inyección. Los emulsionantes se usan comúnmente en vacunas en emulsión. Además de usar emulsionantes, la estabilidad de las vacunas en emulsión también puede lograrse reduciendo el tamaño de gotita de la emulsión por medios mecánicos.

La patente de EE.UU. nº 5.084.269 se refiere a una formulación de coadyuvante que contiene lecitina en combinación con aceite mineral que produce menos irritación dentro del animal huésped, y simultáneamente induce elevada inmunidad sistémica. Las composiciones según la patente de EE.UU. 5.084.269 están en uso comercial bajo el nombre comercial AMPHIGEN®, una marca registrada de Pfizer, Inc.

Generalmente, los antígenos bacterianos son inestables cuando se calientan e incluso una breve exposición a temperaturas elevadas puede reducir la actividad de los antígenos. Por ejemplo, las actuales vacunas anticarbuncosas pueden perder toda la actividad biológica en 48 horas a 37 ºC (S. Sing, N. Ahuja, V. Chauhan, E. Rajasekaran, W. S. Mohsin, R. Bhat, y R. Bhatnagar; Bioche. Biophys. Res. Commun. 2002 Sep. 6; 295 (5) :1058-62) .

Zeigler y col. (Bulletin of the Pan American Health Organization, vol.10 (Nº2) :126-130 (1976) ) describe preparaciones de vacuna de células completas para inmunización frente a Leptospira en las que la bacterina se prepara en solución salina para inyección al 0, 85 %estéril. Zeigler y col. no combina la bacterina con una emulsión. El tratamiento térmico de Zeigler y col. es a 56 ºC durante 30 min y se usa para matar las bacterias.

Resumen de la invención La presente invención se refiere a bacterinas tratadas térmicamente, a un procedimiento de producción de bacterinas tratadas térmicamente y a vacunas en emulsión preparadas a partir de tales bacterinas tratadas térmicamente. El procedimiento comprende calentar la bacterina a una temperatura de aproximadamente 35 a aproximadamente 80 ºC para formar una bacterina tratada térmicamente.

Descripción detallada Definiciones Actividad antigénica aceptable -El término "actividad antigénica aceptable" significa la capacidad para inducir una respuesta inmunitaria protectora en animales vacunados después de provocarse o de pasar una prueba de potencia codificada con organismo vivo homólogo.

Bacterina -El término "bacterina" significa una suspensión de bacterias muertas que puede usarse como componente de una vacuna.

Emulsionante -El término "emulsionante" significa una sustancia usada para preparar una emulsión más estable.

Emulsión -El término "emulsión" significa una composición de dos líquidos inmiscibles en la que pequeñas gotitas de un líquido están suspendidas en una fase continua del otro líquido.

Bacterina tratada térmicamente -El término "bacterina tratada térmicamente" significa una bacterina que se ha tratado con calor y que tiene una actividad de lipasa del 50% o inferior a la actividad de lipasa antes del tratamiento térmico, y que tiene actividad antigénica aceptable.

Emulsión inversa -El término "emulsión inversa" significa una emulsión de agua en aceite.

Lipasa -El término "lipasa" significa enzimas esterasas, lipasas y fosfolipasas que pueden producir la rotura de un emulsionante en una vacuna en emulsión.

Emulsión normal -El término "emulsión normal" significa una emulsión de aceite en agua.

Emulsión de aceite en agua -El término "emulsión de aceite en agua" significa una emulsión en la que pequeñas gotitas de aceite están suspendidas en una fase acuosa continua.

Temperatura ambiente -El término "temperatura ambiente" significa una temperatura de 18 a 25 ºC.

Emulsión de agua en aceite -El término "emulsión de agua en aceite" significa una emulsión en la que gotitas de agua están suspendidas en una fase aceitosa continua.

Descripción La presente invención se refiere a bacterinas de Leptospira con actividad de lipasa reducida, a vacunas preparadas a partir de tales bacterinas y a un procedimiento de reducción de la actividad de lipasa de bacterinas. Además de componentes antigénicos, algunas bacterinas tienen actividad de lipasa. Cuando las bacterinas con actividad de lipasa se incorporan en una emulsión, la lipasa puede romper los emulsionantes usados para crear la emulsión. Las vacunas en emulsión que contienen bacterinas que tienen alta actividad de lipasa tienden a ser emulsiones inestables, y aquellas que contienen bacterinas que tienen bajos niveles de lipasa tienden a ser estables. Ejemplos de bacterias que pueden, cuando mueren, producir bacterinas que tienen actividad de lipasa incluyen Acinetobacter calcoaceticus, Acetobacter paseruianus, Aeromonas hydrophila, Alicyclobacillus acidocaldarius, Arhaeglobus fulgidus, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophillus, Bacillus subtilis, Bacillus thermocatenulatus, Burkholderia cepacia, Burkholderia glumae, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter hyointestinalis, Chlamydia trachomatis, Chromobacterium viscosum, Er y sipelothrix rhusiopathieae, Listeria monocytogenes Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Lawsonia intracellularis, Legionella pneumophilia, Moraxellsa sp., Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides LC, Clostridium perfringens, Photorhabdus luminescens, Propionibacterium acnes, Proteus vulgaris, Pseudomonas wisconsinensis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens C9, Pseudomonas fluorescens SIKW1, Pseudomonas fragi, Pseudomonas luteola, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas sp B11-1, Alcaliges eutrophus, Psychrobacter immobilis, Rickettsia prowazekii, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Spirlina platensis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hyicus, Streptomyces albus, Streptomyces cinnamoneus, Streptomyces exfoliates, Streptomyces scabies, Sulfolobus acidocaldarius, Syechocystis sp., Vibrio cholerae, Borrelia burgdorferi, Treponema denticola, Treponema minutum, Treponema phagedenis, Treponema refringens, Treponema vincentii, Treponema palladium y especies de Leptospira, tales como los patógenos conocidos Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona.

La lipasa, que puede romper los emulsionantes usados para crear la emulsión, y así producir inestabilidad y rotura de la emulsión, puede incluir una o más enzimas que rompen emulsiones tales como esterasas, lipasas y fosfolipasas. Conjuntamente, estas enzimas, esterasas, lipasas y fosfolipasas se denominan lipasa. La actividad de lipasa de una bacterina puede medirse usando un sustrato sintético llamado O-pivaloiloximetilumbeliferona (C-POM) . La tasa de hidrólisis producida por la lipasa es la medida de la actividad de lipasa. La tasa de reacción de la hidrólisis producida por la lipasa en esta reacción se monitoriza por un aumento en la intensidad de fluorescencia del producto de la actividad de lipasa. La tasa de reacción depende de las condiciones de prueba de la hidrólisis exactas elegidas, de manera que deben hacerse comparaciones de niveles de actividad de lipasa, medida mediante tasas de hidrólisis, usando los datos producidos por las mismas condiciones de prueba. Procedimientos bibliográficos se desvelan en varios artículos, que incluyen Kurioka S. y Matsuda M. (1976) Ana. Biochem. 75: 281-289, De Silva NS y Quinn PA. (1987) J. Clin. Microbiol.

25: 729-731, y Grau, A., y Ortiz, A. (1998) Chem. Phys. of Lipids. 91: 109-118.

En una vacuna en emulsión, la rotura de la emulsión produce separación de fases de los componentes. Esto es no deseable debido a que cuando hay separación de fases, la dosis individual sacada del recipiente puede no contener el mismo nivel de componentes de vacuna. Además, la pérdida de emulsión puede conducir a una pérdida de la actividad del coadyuvante del emulsionante y conducir a una... [Seguir leyendo]

1. Una bacterina de Leptospira tratada térmicamente para su uso en una vacuna en emulsión que comprende una suspensión de bacterias muertas que tienen una actividad de lipasa del 50 % o inferior a la actividad de lipasa de la bacterina antes del tratamiento térmico en la que el tratamiento térmico comprende calentar la bacterina que tiene actividad de lipasa a una temperatura de 60 a 70 ºC durante 5 a 10 horas.

2. La bacterina tratada térmicamente según la reivindicación 1, en la que dichas bacterias de Leptospira tratadas térmicamente se preparan mediante un procedimiento que comprende calentar la bacterina a una temperatura de 65 ºC durante 8 horas.

3. La bacterina tratada térmicamente según las reivindicaciones 1 o 2, en la que las bacterias muertas son de una a cinco

especies de Leptospira seleccionadas del grupo que consiste en Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona.

4. La bacterina tratada térmicamente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además virus vivos.

5. La bacterina tratada térmicamente según la reivindicación 1, que comprende además una preparación de lecitina, Quil 15 A y colesterol

6. La bacterina tratada térmicamente según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende además virus muertos.

7. La bacterina tratada térmicamente según la reivindicación 5, que comprende además virus muertos

8. La bacterina tratada térmicamente según la reivindicación 4, en la que los virus vivos son de uno a tres virus

seleccionados del grupo que consiste en virus de la rinotraqueítis bovina (RBI) , virus de la paragripe 3 (PI3) y virus respiratorio sincitial bovino (VRSB) .

9. La bacterina tratada térmicamente según la reivindicación 7, en la que los virus muertos son de uno a dos virus seleccionados del grupo que consiste en diarrea vírica bovina tipo 1 (DVB) y diarrea vírica bovina tipo 2 (DVB) .