Composiciones coadyuvantes glucolipídicas novedosas.

Una composición que comprende:

a) un glucolípido de fórmula I;

en el que la fórmula I es

en la que

R1 y R2 son independientemente hidrógeno o un radical alquilo saturado que tiene hasta 20 átomos de carbono;

X es -CH2-, -O- o -NH-;

R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno, -SO4

2-, -PO4

2-, -CO-alquilo C1-10;

R6 es L-alanilo, L-alfa-aminobutilo, L-arginilo, L-asparginilo, L-aspartilo, L-cisteinilo, L-glutamilo, L-glicilo, L-histidilo,

L-hidroxipropilo, L-isoleucilo, L-leucilo, L-lisilo, L-metionilo, L-ornitinilo, L-fenilalanilo, L-prolilo, L-serilo, L-treonilo, Ltirosilo,L-triptofanilo y L-valilo o sus isómeros D; en una forma de sal, en la que la forma de sal deriva de un ácido

débil,

b) un alcohol, en el que el alcohol es HO-alquilo C1-3;

c) un ácido débil, en el que el ácido débil

1) está en una cantidad desde 1,25 hasta 5,0 veces la cantidad del glucolípido, en equivalentes molares alglucolípido y

2) es cualquier ácido que tenga un valor de pKa (el -log de Ka) entre 1,0 y 9,5 utilizando las tablas o valoresestándar;

d) un tensioactivo no iónico, en el que el tensioactivo no iónico es un agente que reduce la tensión superficialdel material que se disuelve en él y tiene un componente que es hidrófobo y otro componente que es hidrófilo.

Composiciones coadyuvantes glucolipídicas novedosas Campo de la invención La presente invención se refiere a composiciones de coadyuvantes glucolipídicos novedosas, a procedimientos parasu uso y a su preparación. Las nuevas composiciones de la presente invención son estables durante una largaduración sin floculación. Son particularmente útiles en el suministro de diversas medicinas, incluyendo vacunas.

Antecedentes de la invención Las vacunas se utilizan típicamente para proteger a seres humanos y animales veterinarios de enfermedadesinfecciosas causadas por bacterias, virus y organismos parásitos. Los antígenos utilizados en vacunas pueden ser cualquier variedad de agentes, pero están compuestos típicamente por organismos patógenos muertos, organismospatógenos que están vivos pero modificados o atenuados, proteínas, proteínas recombinantes o fragmentos de lasmismas. Cualquiera que sea la fuente del antígeno, a menudo es necesario añadir un coadyuvante para potenciar larespuesta inmune del huésped al antígeno.

Los coadyuvantes se utilizan para conseguir dos objetivos: retardan la liberación de los antígenos desde el sitio deinyección y estimulan el sistema inmune.

El primer coadyuvante reseñado en la bibliografía fue el coadyuvante completo de Freund (FCA) . El FCA contieneuna emulsión de agua en aceite y extractos de micobacterias. Los extractos de micobacterias proporcionanmoléculas inmunoestimulantes en forma bruta. La emulsión de agua en aceite actúa creando un efecto de depósitodonde los antígenos se liberan lentamente. Desgraciadamente el FCA es poco tolerado y puede causar inflamaciónincontrolada. Desde el descubrimiento del FCA hace 80 años se han realizado esfuerzos para reducir los efectossecundarios indeseados de los coadyuvantes.

Actualmente se conocen análogos glucolipídicos que comprenden una nueva clase de compuestos que tienenpropiedades coadyuvantes. La patente de EE.UU. N.º: 4.855.283 (en adelante en la presente memoria ‘283) da aconocer la síntesis de análogos glucolipídicos, incluyendo N-glucosilamidas, N-glucosilureas, carbamatos de Nglucosilo y específicamente: acetato de N- (2-desoxi-2-L-leucilamino-º-D-glucopiranosil) -N-octadecildodecanamida (conocido como Bay R1005, O. Lockhoff, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., (1991) 30: 1611-1620) . Los compuestosdescritos en la patente ‘283 son particularmente adecuados para su uso como coadyuvantes.

Las formulaciones coadyuvantes glucolipídicas necesitan ser fáciles de fabricar y estables cuando se almacenandurante largos periodos de tiempo sin mostrar floculación del componente lipídico. Las formas no acetato de lasamidas glucolipídicas o glucosilamidas son altamente insolubles y típicamente se separan por floculación de lasolución tras almacenamiento a temperatura ambiente o inferior.

Las soluciones y coadyuvantes que comprenden glucosilamidas proporcionados aquí muestran poca floculación y son bastante estables. Son fáciles de fabricar y pueden prepararse a escala comercial. Las formulaciones coadyuvantes glucolipídicas líquidas pueden utilizarse como diluyente para rehidratar una preparación de antígeno liofilizado. Se proporcionan también procedimientos para ensayar la estabilidad de estas formulaciones a tiempo realy mediante protocolos de ensayo de estabilidad acelerada.

Sumario de la invención El alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones y cualquier información que no entre dentro delas reivindicaciones se proporciona solamente para información.

Esta invención comprende la composición y el procedimiento de preparación o fabricación tanto de solución madre de glucosilamida como de solución coadyuvante glucolipídica. La solución madre de glucosilamida se preparadisolviendo un glucolípido de fórmula I en un alcohol y combinando esto con una cantidad apropiada de un ácidodébil más un tensioactivo “no iónico”. El ácido débil se añade a la solución de alcohol glucolipídico en un excesomolar de ácido débil con respecto al glucolípido. En una realización, el glucolípido es hidroacetato de N- (2-desoxi-2L-leucilamino-º-D-glucopiranosil) -N-octadecildodecanoilamida. En una realización, el alcohol es etanol. En una realización, el ácido débil es ácido acético. En una realización, los tensioactivos no iónicos son diversos sorbitanos (Span®) o polioxietilensorbitanos (Tween®) , en particular monolaurato de sorbitanos (Span 20®) y monolaurato depolioxietilensorbitanos (Tween 20®) . La solución coadyuvante glucolipídica se prepara introduciendo una cantidadapropiada de la solución madre de glucosilamida en un “tampón adecuado”. El pH de las soluciones coadyuvantes glucolipídicas estables finales aquí descritas debe ser entre aproximadamente 6 y aproximadamente 8. Se prefiere un pH final de entre aproximadamente 6 y aproximadamente 7. Se describe un pH final de entre aproximadamente6, 3 a aproximadamente 6, 4. Deben evitarse concentraciones altas de sal de coadyuvante glucolipídico, aquellas que exceden de NaCl 30 mM.

Estas dos soluciones se ejemplifican con más detalle a continuación:

La solución madre de glucosilamida es una composición que comprende:

a) un glucolípido de fórmula I;

en el que la fórmula I es en la que R1 es hidrógeno o radical alquilo saturado que tiene hasta 20 átomos de carbono; X es –CH2-, -O- o –NH-;

R2 es hidrógeno o radical alquilo saturado que tiene hasta 20 átomos de carbono; R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno, -SO42-, -PO42-, -CO-alquilo C1-10; R6 es L-alanilo, L-alfa-aminobutilo, L-arginilo, L-asparginilo, L-aspartilo, L-cisteinilo, L-glutamilo, L-glicilo, L-histidilo,

L-hidroxipropilo, L-isoleucilo, L-leucilo, L-lisilo, L-metionilo, L-ornitinilo, L-fenilalanilo, L-prolilo, L-serilo, L-treonilo, Ltirosilo, L-triptofanilo y L-valilo o sus isómeros D; en una forma de sal, en la que la forma de sal se deriva de un ácido10 débil;

b) un alcohol, en el que el alcohol es HO-alquilo C1-3; c) un ácido débil, en el que el ácido débil 1) está en exceso molar con respecto al contenido de glucolípido y 2) es cualquier ácido que tenga un valor de pKa entre aproximadamente 1, 0 y aproximadamente 9, 5 utilizando las tablas o valores estándar; y

d) un tensioactivo no iónico, en el que el tensioactivo no iónico es un agente que reduce la tensión superficial del material que se disuelve en él y tiene un componente que es hidrófobo y otro componente que es hidrófilo. La solución coadyuvante glucolipídica es una composición que comprende: a) una solución madre de glucosilamida; y b) un tampón adecuado, en el que el tampón es aquel apropiado para uso veterinario o médico y puede20 mantener un pH relativamente constante en una solución acuosa de entre aproximadamente 6, 0 y aproximadamente 8, 0.

Descripción detallada de la invención A menos que se indique cósalo contrario, los siguientes términos utilizados en la memoria descriptiva y las reivindicaciones tienen los significados dados a continuación.

El término “alcohol” designa un compuesto de fórmula HO-alquilo C1-3. Puede ser metanol, etanol o propanol en cualquier forma, tal como n-propanol o isopropanol. Se prefiere etanol.

El término “alquilo” designa tanto restos hidrocarburo saturados de cadena lineal como ramificada.

El término “glucolípidos” designa los compuestos de fórmula I siguientes. Estos compuestos se describen en lapatente de EE.UU. 6.290.971 y la patente de EE.UU. N.º: 4.855.283, expedida el 8 de agosto de 1989. Tanto la

patente de EE.UU. 6.290.971 como la patente de EE.UU. N.º: 4.855.283 se incorporan a la presente como referencia en su totalidad. Un glucolípido descrito en particular aquí, cuando está en su forma acetato, tiene el nombrecomercial Bay R1005® y el nombre químico “acetato de N- (2-desoxi-2-L-leucilamino-º-D-glucopiranosil) -Noctadecildodecanamida”. La forma amida de este compuesto tiene el nombre comercial Bay 15-1583® y el nombrequímico “N- (2-desoxi-2-L-leucilamino-º-D-glucopiranosil) -N-octadecildodecanamida”.

Los glucolípidos de fórmula I son:

Fórmula I

en la que R1 es hidrógeno o radical alquilo saturado que tiene hasta 20 átomos de carbono; X es –CH2-, -O- o –NH-;

R2 es hidrógeno o radical alquilo saturado que tiene hasta 20 átomos de carbono; R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno, -SO42-, -PO42- o –CO-alquilo C1-10; R6 es L-alanilo, L-alfa-aminobutilo, L-arginilo, L-asparginilo, L-aspartilo, L-cisteinilo, L-glutamilo, L-glicilo, L-histidilo,

L-hidroxipropilo, L-isoleucilo, L-leucilo, L-lisilo, L-metionilo,... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende:

a) un glucolípido de fórmula I; en el que la fórmula I es

en la que R1 y R2 son independientemente hidrógeno o un radical alquilo saturado que tiene hasta 20 átomos de carbono; X es –CH2-, -O- o –NH-; R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno, -SO42-, -PO42-, -CO-alquilo C1-10; R6 es L-alanilo, L-alfa-aminobutilo, L-arginilo, L-asparginilo, L-aspartilo, L-cisteinilo, L-glutamilo, L-glicilo, L-histidilo,

L-hidroxipropilo, L-isoleucilo, L-leucilo, L-lisilo, L-metionilo, L-ornitinilo, L-fenilalanilo, L-prolilo, L-serilo, L-treonilo, Ltirosilo, L-triptofanilo y L-valilo o sus isómeros D; en una forma de sal, en la que la forma de sal deriva de un ácidodébil,

b) un alcohol, en el que el alcohol es HO-alquilo C1-3; c) un ácido débil, en el que el ácido débil

1) está en una cantidad desde 1, 25 hasta 5, 0 veces la cantidad del glucolípido, en equivalentes molares al glucolípido y 2) es cualquier ácido que tenga un valor de pKa (el –log de Ka) entre 1, 0 y 9, 5 utilizando las tablas o valores estándar; d) un tensioactivo no iónico, en el que el tensioactivo no iónico es un agente que reduce la tensión superficial 20 del material que se disuelve en él y tiene un componente que es hidrófobo y otro componente que es hidrófilo.

2. Una composición de la reivindicación 1 en la que el glucolípido es un compuesto de fórmula II (a)

Fórmula II (a)

y el ácido débil es seleccionado de uno o cualquier combinación de los siguientes ácidos débiles: ácido acético,

H (C2H3O2) (pKa 4, 76) ; ácido ascórbico (1) , H2 (C6H6O6) (pKa 4, 10) ; ácido acetilsalicílico, H8 (C9O4) (pKa 3, 5) ; ácido butanoico H (C4H7O2) (pKa 4, 83) ; ácido carbónico, forma 1, H2CO3, (pKa 4, 83) ; ácido crómico, forma 2, HCrO4- (pKa6, 49) ; ácido cítrico, forma 1, H3 (C6H5O7) , (pKa 3, 14) ; ácido cítrico, forma 2, (H2C6H5O7) -, (pKa 4, 77) ; ácido cítrico, forma 3, (HC6H5O7) =, (pKa 6, 39) ; ácido fórmico, H (CHO2) , (pKa 3, 75) ; ácido fumárico, H4 (C4O4) (pKa 3, 03) ; ácido heptanoico, H (C7H13O2) , (pKa 4, 89) ; ácido hexanoico, H (C6H11O2) , (pKa 4, 84) ; ácido fluorhídrico, HF, (pKa 3, 20) ;

isocitrato, H8 (C6O7) (pKa 3, 29) ; ácido láctico, H (C3H5O3) , (pKa 3, 08) ; ácido maleico, H4 (C4O4) (pKa 1, 83) ; ácido nicotínico, H5 (C6NO2) (pKa 3, 39) ; ácido oxálico, forma 1, H2 (C2O4) , (pKa 1, 23) ; ácido oxálico, forma 2, (HC2O4) -, (pKa 4, 19) ; ácido pentanoico, H (C5H9O2) , (pKa 4, 84) ; ácido fosfórico, forma 1, H3PO4, (pKa 2, 16) ; ácido propanoico, H (C3H5O2) , (pKa 4, 86) ; ácido pirúvico, H4 (C3O3) (pKa 2, 39) ; y ácido succínico H6 (C4O4) (pKa 4, 19) .

3. Una composición de la reivindicación 2, en la que el glucolípido es un compuesto de fórmula II (b)

Fórmula II (b)

y el ácido débil es seleccionado de uno o de cualquier combinación de los siguientes ácidos débiles: ácido acético;ácido acetilsalicílico; ácido cítrico; ácido fórmico; ácido fumárico; ácido fluorhídrico; isocitrato; ácido maleico; ácido nicotínico; ácido fosfórico; ácido pirúvico; y ácido succínico.

4. Una composición de la reivindicación 3, en la que el glucolípido es acetato de N- (2-desoxi-2-L-leucilaminoº-D-glucopiranosil) -N-octadecildodecanamida, que tiene una estructura de fórmula III:

Fórmula III 10 y el ácido débil es ácido acético.

5. Una composición de la reivindicación 2, en la que el ácido débil es seleccionado del grupo que consiste en:ácido acético; ácido acetilsalicílico; ácido cítrico, forma 1; ácido cítrico, forma 2; ácido cítrico, forma 3; ácido fórmico; ácido fumárico; ácido fluorhídrico; isocitrato; ácido maleico; ácido nicotínico; ácido fosfórico, forma 1; ácido pirúvico y ácido succínico.

6. Una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que dicho ácido débil está en una cantidad que es las siguientes veces mayor que el equivalente molar del glucolípido; a) 1, 25 veces mayor, b) 2, 0 veces mayor, c) 2, 5 veces mayor, 20 d) 2, 7 veces mayor, e) 3, 0 veces mayor,

f) 5, 0 veces mayor, que la cantidad equivalente molar del glucolípido.

7. Una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el alcohol es alcohol etílico.

8. Una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que dicho tensioactivo no iónico es seleccionado de uno cualquiera o de una combinación del grupo que consiste en: monolaurato de sorbitán, monopalmitato de sorbitán, monoestearato de sorbitán, triestearato de sorbitán, monooleato de sorbitán, trioleato desorbitán, monolaurato de polioxietilensorbitán, monopalmitato de polioxietilensorbitán, monoestearato de polioxietilensorbitán, monooleato de polioxietilensorbitán, trioleato de polioxietilensorbitán y otros sorbitanos y

polioxietilensorbitanos utilizados habitualmente en vacunas.

9. Una composición de la reivindicación 1, en la que el ácido débil es ácido acético y adicionalmente en la que el ácido acético está en una cantidad que es 2, 0 veces mayor que la cantidad equivalente molar del glucolípido.

10. Una composición de la reivindicación 1, en la que el ácido débil tiene un valor de pKa (el –log de Ka) entre1, 23 y 6, 49 usando tablas o valores estándar. 35 11. Una composición que comprende:

a) un glucolípido de fórmula I; en el que la fórmula I es 21

en la que R1 y R2 son independientemente hidrógeno, o un radical alquilo saturado que tiene hasta 20 átomos de carbono; X es –CH2-, -O- o –NH-; R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno, -SO42-, -PO42-, -CO-alquilo C1-10; R6 es L-alanilo, L-alfa-aminobutilo, L-arginilo, L-asparginilo, L-aspartilo, L-cisteinilo, L-glutamilo, L-glicilo, L-histidilo,

L-hidroxipropilo, L-isoleucilo, L-leucilo, L-lisilo, L-metionilo, L-ornitinilo, L-fenilalanilo, L-prolilo, L-serilo, L-treonilo, Ltirosilo, L-triptofanilo y L-valilo o sus isómeros D; en una forma de sal, en la que la forma de sal deriva de un ácidodébil;

b) un alcohol, en el que el alcohol es HO-alquilo C1-3; c) un ácido débil, en el que el ácido débil 1) está en una cantidad desde 1, 25 hasta 5, 0 veces la cantidad del glucolípido, en equivalentes molares al

glucolípido y

2) es cualquier ácido que tenga un valor de pKa (el –log de Ka) entre 1, 0 y 9, 5 utilizando las tablas o valores estándar; d) un tensioactivo no iónico, en el que el tensioactivo no iónico es un agente que reduce la tensión superficial

del material que se disuelve en él y tiene un componente que es hidrófobo y otro componente que es hidrófilo; y e) un tampón acuoso, en la que el tampón adecuado es adecuado para uso en vacuna y puede mantener elpH de los demás ingredientes dentro de un intervalo de pH de 6 a 8, con la condición de que no se utilice NaCl másde 50 mM.

12. Una composición de la reivindicación 11, en la que el pH de la solución es ajustado a un pH relativamenteconstante en una solución acuosa de entre 6 y 7 y el tampón es seleccionado del grupo que consiste en tamponesfosfato que tienen cualquiera o ambas de las sales monobásicas y dibásicas de fosfato de sodio y/o fosfato depotasio en la misma o en diferentes proporciones.

13. Una composición de la reivindicación 11, en la que dicho tampón es seleccionado del grupo de: a) ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico (también conocido como MES) ; b) ácido 3- (N-morfolino) propanosulfónico (también conocido como MOPS) ; c) ácido N-[tris (hidroximetil) ]-2-aminoetanosulfónico (también conocido como TES) ; d) ácido 4- (2-hidroxietil) piperazin-1-etanosulfónico (también conocido como HEPES) ; y e) [tris (hidroximetil) metil]glicina (también conocida como TRIS) ;

o cualquier combinación de los mismos.

14. Una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 que comprende adicionalmente un antígeno seleccionado del grupo, o cualquier combinación de los mismos, que consiste en herpesvirus bovino vivomodificado, virus sincitial respiratorio bovino vivo modificado y virus paragripal tipo 3 vivo modificado.

15. Una composición que comprende:

a) acetato de N- (2-desoxi-2-L-leucilamino-º-D-glucopiranosil) -N-octadecildodecanamida, que tiene una estructura de fórmula III:

Fórmula III

b) etanol;

c) ácido acético, en la que el ácido acético está en una cantidad de 1, 25 a 5, 0 veces la cantidad delglucolípido, en equivalentes molares al glucolípido; d) tensioactivo no iónico seleccionado de: monolaurato de sorbitán, monopalmitato de sorbitán, monoestearato de sorbitán, triestearato de sorbitán, monooleato de sorbitán, trioleato de sorbitán, monolaurato de polioxietilensorbitán, monopalmitato de polioxietilensorbitán, monoestearato de polioxietilensorbitán, monooleato depolioxietilensorbitán, trioleato de polioxietilensorbitán;

e) un tampón acuoso en el que el pH de la solución es ajustado a un pH relativamente constante en una solución tamponada acuosa de entre 6 y 7, y el tampón se selecciona del grupo de: a) ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico (también conocido como MES) ; b) ácido 3- (N-morfolino) propanosulfónico (también conocido como MOPS) ; c) ácido N-[tris (hidroximetil) ]-2-aminoetanosulfónico (también conocido como TES) ; d) ácido 4- (2-hidroxietil) piperazin-1-etanosulfónico (también conocido como HEPES) ; y e) [tris (hidroximetil) metil]glicina (también TRIS) ;

o cualquier combinación de los mismos; con la condición de que no se utilice NaCl más de 15 mM y: f) un antígeno que consiste esencialmente en herpesvirus bovino vivo modificado, virus sincitial respiratorio

bovino vivo modificado y virus paragripal tipo 3 vivo modificado.

16. Un procedimiento de preparación de una composición, que comprende mezclar conjuntamente lo siguiente: a) un glucolípido de fórmula I; b) un alcohol, en el que el alcohol es HO-alquilo C1-3; c) un ácido débil orgánico, en el que el ácido débil 1) está en una cantidad desde 1, 25 hasta 5, 0 veces la cantidad del glucolípido, en equivalentes molares al

glucolípido; y

2) es cualquier ácido que tenga un valor de pKa (el –log de Ka) entre 1 y 9, 5 utilizando las tablas o valores estándar; y d) un tensioactivo no iónico.

17. Un procedimiento de preparación de una composición, que comprende mezclar conjuntamente lo siguiente: a) un glucolípido de fórmula I; b) un alcohol, en el que el alcohol es HO-alquilo C1-3; c) un ácido débil orgánico, en el que el ácido débil 1) está en una cantidad desde 1, 25 hasta 5, 0 veces la cantidad del glucolípido, en equivalentes molares al

glucolípido; y

2) es cualquier ácido que tenga un valor de pKa (el –log de Ka) entre 0, 7 y 9, 5 utilizando las tablas o valores estándar; d) un tensioactivo no iónico; y añadir después e) un tampón adecuado.