Anticuerpos seleccionados que se unen a aminofosfolípidos y su uso en el tratamiento del cáncer.

Una composición que comprende un anticuerpo purificado, o fragmento de unión a antígeno o inmunoconjugado del mismo,

en el que dicho anticuerpo:

(a) comprende una región variable de cadena pesada que incluye los restos de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las posiciones de aminoácidos 31-35 (CDR H1), 50-56 (CDR H2) y 95-102 (CDR H3) de la SEC ID Nº: 2, y una región variable de cadena ligera que incluye los restos de aminoácidos de las CDR de las posiciones de aminoácidos 24-34 (CDR L1), 50-56 (CDR L2) y 89-97 (CDR L3) de la SEC ID Nº: 4;

(b) se une a fosfatidilserina en un ELISA realizado en presencia de suero al 10 % y comprende una región variable de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; o una región variable de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4; o

(c) se une a fosfatidilserina en un ELISA realizado en presencia de suero al 10 % y comprende una región variable de cadena pesada que incluye una variante o forma mutagenizada de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; en la que dicha variante o forma mutagenizada tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 96 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; y una región variable de cadena ligera que incluye una variante o forma mutagenizada de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4, en la que dicha variante o forma mutagenizada tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 96 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4;

y en la que dicho ELISA tiene el protocolo:

la placa de 96 pocillos se recubre con fosfatidilserina (FS) de la siguiente manera:

- diluir la solución madre de FS en n-hexano a 10 μg/μl y mezclar bien

- añadir 50 μl a cada pocillo y permitir que éste se evapore durante una hora añadir a cada pocillo 200 μl de tampón de bloqueo, donde dicho tampón de bloqueo es suero bovino al 10 % disuelto en PBS, cubrir y conservar a temperatura ambiente durante 2 horas o durante una noche a 4 ºC lavar la placa tres veces con PBS

añadir anticuerpo primario a la muestra de ensayo diluido en dicho tampón de bloqueo e incubar durante 2 horas a 27 ºC lavar la placa tres veces con PBS

añadir 100 μl/pocillo de anticuerpo secundario (anti-IgG de ratón, de cabra, conjugado con HRP u otro anticuerpo secundario apropiado) e incubar durante 1 hora a 37 ºC

lavar la placa tres veces con PBS

revelar el ELISA añadiendo 100 μl de solución reveladora a cada uno de los pocillos, revelar durante 10 minutos, después añadir a cada pocillo 100 μl de solución determinación y leer la densidad óptica 490 nm siendo la solución reveladora Na2PO4 0,2 M, 10 ml de ácido cítrico 0,1 M y un comprimido de 10 mg de o-fenilendiamina y 10 μl de peróxido de hidrógeno

siendo la solución de terminación H2SO4 0,18 M.

Anticuerpos seleccionados que se unen a aminofosfolípidos y su uso en el tratamiento del cáncer ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a los campos de la biología de los aminofosfolípidos y de los fosfolípidos aniónicos y de vasos sanguíneos tumorales. Sorprendentemente proporciona nuevas composiciones, y sus usos y combinaciones que se dirigen a la vasculatura tumoral y al tratamiento del cáncer. La invención proporciona además diversas composiciones de anticuerpos e inmunoconjugados que se unen e inhiben a aminofosfolípidos y a fosfolípidos aniónicos para su uso en el tratamiento del cáncer y enfermedades relacionadas.

2.- Descripción de la técnica relacionada

La resistencia de las células de tumores a los agentes qulmioterapéuticos representa un problema significativo en la oncología clínica. Otro problema principal que hay que abordar en el tratamiento de tumores, es el deseo de lograr una "destrucción total de las células", es decir, destruir todas las células neoplásicas conocidas como "clonogénicas" que tienen la capacidad de crecer de manera Incontrolada y reemplazar cualquier masa tumoral que pueda eliminarse mediante la terapia. A pesar de determinados avances en el campo, existen dos razones principales por las cuales muchas formas frecuentes de cáncer humano resisten aún la intervención quimioterapéutica eficaz.

Debido al objetivo de desarrollar tratamientos que se enfoquen a una destrucción total de las células, determinados tipos de tumores han sido más susceptibles a la terapia que otros. Por ejemplo, los tumores de tejidos blandos, por ejemplo, linfomas y tumores de la sangre y órganos formadores de sangre, por ejemplo, leucemias, han sido generalmente más sensibles a la terapia quimioterapéutica que los tumores sólidos, tales como los carcinomas.

Una razón de la susceptibilidad de los tumores blandos y los tumores basados en sangre, a la quimioterapia, es la mayor facilidad de acceso del linfoma y de las células leucémicas, a la intervención quimioterapéutica. En pocas palabras, es mucho más difícil que la mayoría de los agentes quimioterapéuticos lleguen a todas las células de una masa de tumor sólido que a los tumores blandos y a los tumores basados en sangre, y por lo tanto es mucho más difícil lograr una destrucción total de las células. El aumento de la dosis de los agentes quimioterapéuticos produce más frecuentemente efectos secundarios tóxicos, lo que limita generalmente la eficacia de los agentes antitumorales convencionales.

Otra estrategia para el tratamiento de tumores es el uso de una "inmunotoxina", en la que se usa un anticuerpo de células antitumorales, para suministrar una toxina a las células tumorales. Sin embargo, en común con los enfoques quimioterapéuticos, la terapia con inmunotoxinas también tiene desventajas significativas cuando se aplica a tumores sólidos. Por ejemplo, células negativas a antígenos o deficientes de antígenos pueden sobrevivir y volver a poblar el tumor o conducir a metástasis adicionales. Una razón adicional de la resistencia de los tumores sólidos a las terapias basadas en anticuerpos, es que la masa tumoral es generalmente impermeable a agentes macromoleculares tales como anticuerpos e inmunotoxinas. Tanto las distancias para la difusión física como la presión intersticial, dentro del tumor, son limitaciones significativas a este tipo de terapia.

Una estrategia de tratamiento mejorada es dirigirse a la vasculatura de los tumores sólidos. El direccionamiento a los vasos sanguíneos de los tumores, en vez de a las propias células tumorales, tiene determinadas ventajas porque es improbable que conduzca al desarrollo de células tumorales resistentes, y porque las células diana son fácilmente accesibles. Además, la destrucción de los vasos sanguíneos conduce a una amplificación del efecto antitumoral, ya que muchas células tumorales dependen de un solo vaso para obtener su oxígeno y nutrientes. En las patentes de Estados Unidos Nos 5,855,866, 5,965,132, 6,261,535, 6,051,230 y 6,451,312 se describen agentes de direccionamiento vascular (ADV) ejemplares, que describen el suministro dirigido de agentes anticelulares y toxinas a marcadores de vasculatura tumoral.

Otra versión eficaz del enfoque de direccionamiento vascular es dirigirse a un factor de coagulación en un marcador expresado o adsorbido dentro de la vasculatura tumoral o estroma (Huang et al., 1997; patentes de Estados Unidos Nos 6.093.399, 6.004.555, 5.877.289 y 6.036.955). El suministro de coagulantes, en vez de toxinas, a la vasculatura tumoral, tiene las ventajas adicionales de una inmunogenicidad reducida e incluso menores riesgos de efectos secundaros tóxicos. Como se describe en la patente de Estados Unidos 5.877.289, un factor de coagulación preferido para su uso en dichos "coaguligandos" específicos de tumor, es una versión truncada de la proteína humana inductora de la coagulación, el Factor Tisular (TF), el principal iniciador de la coagulación sanguínea.

Recientemente se identificaron los aminofosfolípidos fosfatidilserina (FS) y fosfatidiletanolamina (FE) como marcadores específicos de vasculatura tumoral (Ran ef al., 1998). Esto condujo al desarrollo de nuevos inmunoconjugados anti-FS y anti-FE para suministrar agentes anticelulares, toxinas y factores de coagulación, a los vasos sanguíneos tumorales (patente de Estados Unidos N° 6.312.694). Además se descubrió que anticuerpos no

conjugados con FS y FE ejercían un efecto anticanceroso sin conexión con un agente terapéutico, lo que llegó a conocerse como el enfoque de "anticuerpo desnudo" aminofosfolipídico para el tratamiento y direccionamiento vascular tumoral (patente de Estados Unidos N° 6.406.693).

Aunque los métodos anteriores de direccionamiento vascular aminofosfolipídico y con inmunoconjugados representan avances significativos en el tratamiento de tumores, ciertas células tumorales periféricas pueden sobrevivir a la destrucción generalizada del tumor causada por dichas terapias. Se contemplan por tanto estrategias antiangiogénicas, que inhiban el desarrollo de nueva vasculatura de vasos sanguíneos preexistentes y/o de células madre endoteliales circulantes, para su uso en combinación con los métodos de ADV, de direccionamiento con coaguligandos y aminofosfolípidos de las patentes de Estados Unidos Nos 5.855.866, 6.093.399, 6.312.694 y 6.406.693.

La angiogénesis juega un papel importante en procesos fisiológicos, tales como embriogénesis, cicatrización de heridas y menstruación, pero también está implicada en determinados sucesos patológicos, tales como, el crecimiento de tumores, artritis, psoriasis y retinopatía diabética (Ferrara, 1995). Como se aplican al tratamiento de tumores, las estrategias antiangiogénicas se basan en inhibir la proliferación de vasos germinales, generalmente en la periferia de un tumor sólido. Estas terapias se aplican principalmente para reducir el riesgo de micrometástasis o para inhibir el crecimiento adicional de un tumor sólido después de una intervención más convencional (tal como cirugía o quimioterapia).

Las patentes de Estados Unidos Nos 6.342.219, 6.524.583, 6.342.221 y 6.416.758 describen anticuerpos e inmunoconjugados que se unen al factor A de crecimiento endotelial vascular (VEGF, anteriormente conocido como factor de permeabilidad vascular, FPV), un estimulante primario de la angiogénesis. Estos anticuerpos tienen la ventaja importante de inhibir la unión del VEGF únicamente a uno de los dos receptores primarios del VEGF. Bloqueando la unión del VEGF al VEGFR2, pero no al VEGFR1, estos anticuerpos tienen un perfil de seguridad mejorado, manteniendo efectos beneficiosos mediados por el VEGFR1, por ejemplo, en las funciones de macrófagos, osteoclastos y condroclastos.

Rudikoff et al., Proc. Nati. Acad Sci., USA, 79:1979-1983, 1982, se refieren a una sustitución de aminoácido en la proteína de mieloma de unión a PCho, S107, que altera la especificidad de unión antigénica.

MacCallum et al., J. Mol. Biol., Biol., 262:732-745, 1996, se refieren a análisis de contacto y a la topografía y clasificación de sitos de unión en determinadas interacciones ente el antígeno y el anticuerpo.

De Pascalis et al., J. Immunol., 169:3076-3084, 2002 comunican que solo un tercio de los restos CDR están Implicados en la interacción con el antígeno y se refieren a regiones determinantes de la complementarledad (CDR) con Injerto simplificado para modificar con ingeniería genética anticuerpos monoclonales humanizados ¡nmunogénlcos.

Wu et al., J. Mol. Biol., 294:151-162, 1999, se refieren a la humanización de un anticuerpo monoclonal murlno contra CD40 por la optimización simultánea... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende un anticuerpo purificado, o fragmento de unión a antígeno o inmunoconjugado del mismo, en el que dicho anticuerpo:

(a) comprende una región variable de cadena pesada que incluye los restos de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las posiciones de aminoácidos 31-35 (CDR H1), 50-56 (CDR H2) y 95-102 (CDR H3) de la SEC ID N°: 2, y una región variable de cadena ligera que incluye los restos de aminoácidos de las CDR de las posiciones de aminoácidos 24-34 (CDR L1), 50-56 (CDR L2) y 89-97 (CDR L3) de la SEC ID N°: 4;

(b) se une a fosfatidilserina en un ELISA realizado en presencia de suero al 10 % y comprende una región variable de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2; o una región variable de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 4; o

(c) se une a fosfatidilserina en un ELISA realizado en presencia de suero al 10 % y comprende una región variable de cadena pesada que incluye una variante o forma mutagenizada de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2; en la que dicha variante o forma mutagenizada tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 96 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2; y una región variable de cadena ligera que incluye una variante o forma mutagenizada de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 4, en la que dicha variante o forma mutagenizada tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 96 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 4;

y en la que dicho ELISA tiene el protocolo:

la placa de 96 pocilios se recubre con fosfatidilserina (FS) de la siguiente manera:

- diluir la solución madre de FS en n-hexano a 10 pg/pl y mezclar bien

- añadir 50 pl a cada pocilio y permitir que éste se evapore durante una hora

añadir a cada pocilio 200 pl de tampón de bloqueo, donde dicho tampón de bloqueo es suero bovino al 10 % disuelto en PBS, cubrir y conservar a temperatura ambiente durante 2 horas o durante una noche a 4 °C lavar la placa tres veces con PBS

añadir anticuerpo primario a la muestra de ensayo diluido en dicho tampón de bloqueo e incubar durante 2 horas a 27 °C

lavar la placa tres veces con PBS

añadir 100 pl/pocillo de anticuerpo secundario (anti-lgG de ratón, de cabra, conjugado con HRP u otro anticuerpo secundario apropiado) e incubar durante 1 hora a 37 °C lavar la placa tres veces con PBS

revelar el ELISA añadiendo 100 pl de solución reveladora a cada uno de los pocilios, revelar durante 10 minutos,

después añadir a cada pocilio 100 pl de solución determinación y leer la densidad óptica 490 nm

siendo la solución reveladora Na2PC>4 0,2 M, 10 mi de ácido cítrico 0,1 M y un comprimido de 10 mg de

o-femlendiamina y 10 pl de peróxido de hidrógeno

siendo la solución de terminación H2SO4 0,18 M.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho anticuerpo se une a fosfatidilserina en dicho ELISA y comprende una región variable de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2 o una región variable de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 4.

3. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho anticuerpo se une a fosfatidilserina en dicho ELISA y comprende una región variable de cadena pesada que incluye una variante o forma mutagenizada de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2; en la que dicha variante o forma mutagenizada tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 96 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2; y una región variable de cadena ligera que incluye una variante o forma mutagenizada de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 4, en la que dicha variante o forma mutagenizada tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de aproximadamente el 96 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 4.

4. La composición de la reivindicación 2 o 3, en la que dicho anticuerpo compite eficazmente con el anticuerpo monoclonal 3G4 (depositado como ATCC PTA 4545) por la unión con fosfatildilserina en dicho ELISA.

5. La composición de la reivindicación 3, en la que dicho anticuerpo se une a fosfatidilserina en dicho ELISA y comprende una región variable de cadena pesada que incluye una variante o forma mutagenizada de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2; en la que dicha variante o forma mutagenizada tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 97 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2; y una región variable de cadena ligera que incluye una variante o forma mutagenizada de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 4, en la que dicha variante o forma mutagenizada tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 97 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 4.

6. La composición de la reivindicación 5, en la que dicho anticuerpo se une a fosfatidilserina en dicho ELISA y comprende una región variable de cadena pesada que incluye una variante o forma mutagenizada de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2; en la que dicha variante o forma mutagenizada tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 98 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2; y una región variable de cadena ligera que incluye una variante o forma mutagenizada de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 4, en la que dicha variante o forma mutagenizada tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 98 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 4.

7. La composición de la reivindicación 6, en la que dicho anticuerpo se une a fosfatidilserina en dicho ELISA y comprende una región variable de cadena pesada que incluye una variante o forma mutagenizada de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2; en la que dicha variante o forma mutagenizada tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 99 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2; y una región variable de cadena ligera que incluye una variante o forma mutagenizada de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 4, en la que dicha variante o forma mutagenizada tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 99 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 4.

8. La composición de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que incluye los restos de aminoácidos de las CDR de las posiciones de aminoácidos 31-35 (CDR H1), 50-56 (CDR H2) y 95-102 (CDR H3) de la SEC ID N°: 2, y una región variable de cadena ligera que incluye los restos de aminoácidos de las CDR de las posiciones de aminoácidos 24-34 (CDR L1), 50-56 (CDR L2) y 89-97 (CDR L3) de la SEC ID N°: 4.

9. La composición de la reivindicación 8, en el que dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2 y una región variable de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 4.

10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado, dimérico, trimérico, multimérico, en parte humano, quimérico, biespecífico, recombinante o modificado por ingeniería genética; o un scFv, Fv, Fab, Fab, dímero Fab, diacuerpo, anticuerpo lineal, F(ab)2, CDR, fragmento univalente, camelizado o de dominio sencillo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

11. Una composición que comprende un anticuerpo quimérico, en el que al menos una primera región de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal de ratón 3G4, depositado como ATCC PTA 4545, está unido operativamente a una región constante de anticuerpo humano.

12. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho anticuerpo está unido operativamente a un agente biológico, un agente de diagnóstico o un agente terapéutico adicional.

13. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicho composición es una composición farmacéuticamente aceptable, en la que opcionalmente y preferentemente la composición farmacéuticametne aceptable comprende adicionalmente un agente terapéutico adicional.

14. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicho composición es una composición en aerosol.

15. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicho composición es una composición de liposomas o de nanopartículas farmacéuticamente aceptable; y en el que opcionalmente y preferentemente en la que dicha composición farmacéuticamente aceptable es una composición de liposomas, siendo el liposoma un liposoma furtivo o PEGilado que se recubre con dicho anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo; y en el que opcionalmente y adicionalmente dicho preferentemente liposoma furtivo o PEGilado comprende uno o más agentes terapéuticos adicionales.

16. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en la que dicho agente terapéutico adicional es:

(a) un agente anti-angiogénico o un agente anticanceroso;

(b) una citotoxina, un agente quimioterapéutico, un agente radioterapéutico, un inhibidor de tirosina quinasa, un agente inductor de apoptosis, un esteroide, un antimetabolito, un análogo de ácido fólico, un fármaco anti-tubulina, un inhibidor de topoisomerasa, un taxano, una combretastatina, un antibiótico, un complejo de coordinación de platino, una citocina, un agente alquilante o coagulante;

(c) docetaxel, paclitaxel, 5-fluorouracilo, gemcitabina, irinotecan, cisplatino o carboplatino.

17. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en diagnóstico o en terapia.

18. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en el tratamiento de una enfermedad angiogénica inhibiendo la angiogénesis, preferentemente para su uso en el tratamiento de degeneración macular, artritis, aterosclerosis, retinopatía diabética, hiperplasia tiroidea, enfermedad de Grave, hemangioma, glaucoma neovascular o psoriasis.

19. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en el tratamiento del cáncer.

20. La composición de la reivindicación 19, para su uso en el tratamiento del cáncer en combinación con quimioterapia o radioterapia.

21. La composición de la reivindicación 20, para su uso en el tratamiento del cáncer en combinación con el agente quimioterapéutico docetaxel, paclitaxel, 5-fluorouracilo, gemcitabina, irinotecan, cisplatino o carboplatino.