Mediación en la citotoxicidad de células que muestran expresión en superficie de CD44.

Anticuerpo monoclonal aislado codificado por un hibridoma depositado en IDAC con el número de acceso 280104-06.

Mediación en la citotoxicidad de células que muestran expresión en superficie de CD44.

La presente invención se refiere al diagnóstico y tratamiento de enfermedades cancerosas, en particular a la mediación en la citotoxicidad de las células tumorales, y más particularmente a la utilización de anticuerpos modificadores de enfermedad cancerosa (AMEC) , opcionalmente en combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos, como medio para iniciar la respuesta citotóxica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

CD44 en el cáncer: el cultivo de anticuerpos monoclonales contra los glóbulos blancos humanos ha conducido al descubrimiento del antígeno CD44; una glucoproteína de unión a ácido hialurónico (AH) de cadena sencilla expresada en una amplia diversidad de tejidos normales y sobre todos los tipos de células hematopoyéticas. Originalmente se asoció a la activación y direccionamiento específico de los linfocitos. En la actualidad su papel fisiológico putativo incluye también la activación de genes inflamatorios, la modulación del ciclo celular, la inducción de la proliferación celular, la inducción de la diferenciación y el desarrollo, la inducción de la reorganización citoesquelética y la migración celular y la supervivencia/resistencia celular frente a la apoptosis.

En el ser humano, la única copia génica de CD44 se encuentra situada en el brazo corto del cromosoma 11, 11 p13. El gen contiene 19 exones; los primeros 5 son constantes, los siguientes 9 son variantes, los siguientes 3 son constantes y los 2 finales son variantes. El procesamiento diferencial puede conducir a más de 1.000 isoformas diferentes. Sin embargo, en la actualidad se han identificado varias docenas de variantes naturales.

La glucoproteína CD44 estándar consiste de un dominio N-terminal extracelular (que incluye una secuencia líder de 20 aminoácidos (aa) , y una región proximal membranal (85 aa) ) (270 aa) , una región transmembranal (21 aa) y una cola citoplasmática (72 aa) . La región extracelular contiene además un módulo de unión en el extremo N-terminal. Esta región presenta una longitud de 92 aa y muestra homología respecto a otras proteínas de unión del AH. Existe una elevada homología entre las formas de ratón y humana de CD44. Las formas variantes de la proteína se insertan en el extremo carboxi-terminal del exón 5 y se localizan extracelularmente al expresarse.

También existe naturalmente una forma soluble sérica de CD44 y puede aparecer a partir de un codón de parada (dentro de la región variable) o por la actividad proteolítica. La activación de las células a partir de una diversidad de estímulos, incluyendo TNF-α, resultando en la liberación del receptor CD44. La liberación del receptor también se ha observado con células tumorales y puede resultar en un incremento de la concentración sérica en el ser humano de CD44 de hasta 10 veces. La concentración sérica elevada de CD44 sugiere malignidad (siendo la excepción el cáncer ovárico) .

La forma estándar de CD44 presenta un peso molecular de aproximadamente 37 kD. Las modificaciones posttraduccionales incrementan el peso molecular a 80-90 kD. Entre estas modificaciones se incluyen glucosilaciones amino-terminales N-ligadas al dominio extracelular en los residuos de asparagina, glucosilaciones O-ligadas en los residuos de serina/treonina en el extremo carboxi-terminal del dominio extracelular y adiciones de glucosaminoglicano. Las variantes de procesamiento presentan un tamaño comprendido en el intervalo de entre 80 y 250 kD.

El AH, un polisacárido situado sobre la matriz extracelular (MEC) en los mamíferos, se cree que es el ligando primario de CD44. Sin embargo, se ha encontrado que CD44 se une a proteínas tales como colágeno, fibronectina, laminina, etc. Aparentemente existe una correlación entre la unión de AH y la glucosilación. El antígeno CD44 inactiva (no se une al AH) presenta los niveles más altos de glucosilación, CD44 activa (se une a AH) , los más bajos, mientras que CD44 inducible (no se une o se une débilmente a AH a menos que sea activado por citoquinas, anticuerpos monoclonales, factores de crecimiento, etc.) presenta niveles de glcuosilación en algún punto entre las formas activas e inactivas.

CD44 puede mediar algunas de sus funciones a través de rutas de transducción de señales que dependen de la interacción de la célula, el estímulo y el medio ambiente. Entre algunas de estas rutas se incluyen la cascada de señalización de NFκB (que participa en la respuesta inflamatoria) , la ruta de transducción de señales Ras-MAPK (que participa en la activación del ciclado y proliferación celulares) , la familia de Rho de proteínas (que participa en la reorganización citoesquelética y en la migración celular) y la ruta de señalización relacionada con PI3-K (relacionada con la supervivencia celular) . Todas las funciones anteriormente indicadas se encuentran estrechamente asociadas al inicio y progresión de las enfermedades tumorales. También se ha asociado CD44 a la participación en alguna función en el cáncer a través de una diversidad de mecanismos adicionales. Entre ellos se incluyen la presentación de factores de crecimiento, quimoquinas y citoquinas por proteoglicanos de superficie celular presentes sobre la superficie celular de CD44 a receptores que participan en una neoplasia maligna.

Además, la degradación intracelular del AH por hialuronidasas lisosómicas tras la internalización del complejo CD44-AH puede incrementar potencialmente la probabilidad de invasividad tumoral e inducción de la angiogénesis a través del MEC. Además, la transmisión de señales de supervivencia o apoptóticas se ha demostrado que se produce a través del receptor de CD44 estándar o variable. También se ha sugerido que CD44 participa en la diferenciación y migración celulares. Muchos, o todos, dichos mecanismos dependen del medio y de la célula y varios dan lugar a resultados variables. Por lo tanto, se requiere más investigación antes de que puedan extraerse conclusiones.

Con el fin de validar un potencial papel funcional de CD44 en el cáncer, se han realizado estudios de expresión de CD44 para determinar si la expresión diferencial del receptor se correlaciona con la progresión de la enfermeadd. Sin embargo, se han obtenido resultados inconsistentes en una mayoría de tipos tumorales y ello probablemente se debe a una combinación de diferencias entre reactivos, técnicas, clasificación patológica y diferencias entre tipos celulares de los diferentes investigadores. El carcinoma de células renales y el linfoma no de Hodgkin aparentemente es la excepción en el sentido de que los pacientes con tumores de elevada expresión de CD44 consistentemente presentaban tiempos de supervivencia más cortos que sus contrapartidas de expresión baja o nula de CD44.

Debido a su asociación con el cáncer, CD44 ha sido la diana del desarrollo de terapéuticos anticáncer. Todavía existe controversia sobre si resultan necesarias las formas estándares o variantes de CD44 para la progresión tumoral. Existen datos animales in vivo que apoyan ambos puntos de vista y nuevamente podría depender del tipo tumoral e incluso del tipo celular. Entre los diferentes enfoques terapéuticos se incluyen la inyección de proteínas CD44 solubles, hialuronano ADNc sintasa, hialuronidasa, la utilización de cadena antisentido de CD44 y anticuerpos específicos de CD44. Cada enfoque ha conducido a cierto éxito, proporcionando de esta manera apoyo a los terapéuticos anti-CD44 del cáncer.

Se han generado experimentalmente anticuerpos monoclonales específicos de CD44 tanto variantes como estándares, aunque en su mayor parte estos anticuerpos no presentan actividad biológica intrínseca; por el contrario, se unen específicamente al tipo de CD44 que reconocen. Sin embargo, existen algunos que se encuentran activos in vitro o in vivo, aunque generalmente no en ambos casos. Se ha demostrado que varios anticuerpos anti-CD44 median en sucesos celulares. Por ejemplo, el anticuerpo murino A3D8, dirigido contra la forma estándar del antígeno Luterano CD44 de los eritrocitos humanos, se ha demostrado que incrementa la activación de las células T mediada por CDR2 (anticuerpo 9-1) y por CD3 (anticuerpo OKT3) ; otro anticuerpo anti-CD44 presenta efectos similares. A3D8 también indujo la liberación de IL-1 por monocitos y la liberación de IL-2 por linfocitos T. Resulta interesante que la utilización de A3D8 conjuntamente con fármacos tales como la daunorrubicina, la mitoxantrona y el etopósido inhibió la inducción de la apoptosis en células HL60 y NB4 de LMA al anular la generación del segundo mensajero ceramida. El anticuerpo J173, que no presenta actividad intrínseca y se... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo monoclonal aislado codificado por un hibridoma depositado en IDAC con el número de acceso 280104-06.

2. Anticuerpo anti-CD44 que es una forma humanizada del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, en el que la totalidad de las regiones CDR del anticuerpo anti-CD44 humanizado corresponden a las regiones CDR del anticuerpo según la reivindicación 1 y en el que el anticuerpo anti-CD44 humanizado inhibe competitivamente la unión inmunoespecífica del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 y en el que el anticuerpo anti-CD44 humanizado presenta propiedades citotóxicas in vitro contra células tumorales malignas pero no células normales y en el que dicho anticuerpo anti-CD44 quimerizado media en la inhibición del crecimiento tumoral y extensión de la supervivencia en modelos in vivo de cáncer humano.

3. Anticuerpo anti-CD44 que es una forma quimerizada del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, en el que la totalidad de las regiones CDR del anticuerpo anti-CD44 quimerizado corresponden a las regiones CDR del anticuerpo según la reivindicación 1 y en el que el anticuerpo anti-CD44 humanizado inhibe competitivamente la unión inmunoespecífica del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 y en el que el anticuerpo anti-CD44 humanizado presenta propiedades citotóxicas in vitro contra células tumorales malignas pero no células normales y en el que dicho anticuerpo anti-CD44 quimerizado media en la inhibición del crecimiento tumoral y extensión de la supervivencia en modelos in vivo de cáncer humano.

4. Hibridoma aislado depositado en IDAC con el número de acceso 280104-06.

5. Método para iniciar citotoxicidad celular inducida por anticuerpos de células cancerosas en una muestra de tejido seleccionada de entre un tumor humano que comprende:

proporcionar el anticuerpo monoclonal aislado codificado por un hibridoma depositado en IDAC con el número de acceso 280104-06, y

poner en contacto dicho anticuerpo monoclonal aislado con dicha muestra de tejido,

en el que la unión de dicho anticuerpo monoclonal con dicha muestra de tejido induce citotoxicida celular.

6. Fragmento de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, que se une a CD44.

7. Anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 6 conjugado con un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de fracciones citotóxicas, enzimas, compuestos radioactivos y células hematógenas.

8. Anticuerpo monoclonal aislado codificado por un hibridoma depositado en IDAC con el número de acceso 280104-06 para la utilización en el tratamiento de un tumor humano susceptible de citotoxicidad celular inducida por anticuerpos en un mamífero, en el que dicho tumor humano expresa un antígeno CD44 que se une específicamente a dicho anticuerpo monoclonal.

9. Anticuerpo monoclonal para la utilización según la reivindicación 8, en el que dicho anticuerpo monoclonal se conjuga con una fracción citotóxica.

10. Anticuerpo monoclonal para la utilización según la reivindicación 9, en el que dicha fracción citotóxica es un isótopo radioactivo.

11. Anticuerpo monoclonal para la utilización según la reivindicación 8, en el que dicho anticuerpo monoclonal activa el complemento o en el que dicho anticuerpo monoclonal media en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.

12. Anticuerpo monoclonal anti-CD44 para la utilización en el tratamiento de un tumor humano susceptible de citotoxicidad celular inducida por anticuerpos en un mamífero, en el que dicho tumor humano expresa un antígeno CD44 que se une específicamente a dicho anticuerpo monoclonal y en el que dicho anticuerpo monoclonal es una forma humanizada o quimérica del anticuerpo codificado por un hibridoma depositado en IDAC con el número de acceso 280104-06, en el que la totalidad de las regiones CDR del anticuerpo anti-CD44 humanizado o quimerizado corresponden a las regiones de CDR del anticuerpo según la reivindicación 1 y en el que dicho anticuerpo anti-CD44 inhibe competitivamente la unión inmunoespecífica del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 y en el que dicho anticuerpo anti-CD44 humanizado o quimerizado presenta propiedades citotóxicas in vitro contra células tumorales malignas pero no células normales y en el que dicho anticuerpo anti-CD44 humanizado o quimerizado media en la inhibición del crecimiento tumoral y extensión de la supervivencia en modelos in vivo de cáncer humano.