Interferencia de RNA mediadora de moléculas pequeñas de RNA.

Molécula de RNA bicatenario aislada en la forma de dos cadenas de RNA separadas,

en donde cada cadenade RNA tiene una longitud de 19-23 nucleótidos, en donde dicha molécula de RNA es capaz de interferencia deRNA, en donde la molécula de RNA contiene al menos un análogo de nucleótido modificado, para uso en medicina.

Interferencia de RNA mediadora de moléculas pequeñas de RNA.

La presente invención se refiere a características de secuencia y estructurales de moléculas de (ds) RNA bicatenario requeridas para mediar modificaciones de ácido nucleico específicas de la diana tales como la interferencia de RNA 5 y/o metilación del DNA.

La expresión "Interferencia de RNA" (RNAi) fue acuñada después del descubrimiento de que la inyección de dsRNA en el nematodo C. elegans conduce a silenciación específica de genes altamente homólogos en secuencia al dsR-NA administrado (Fire et al., 1998) . La RNAi fue observada también posteriormente en insectos, ranas (Oelgeschlager et al., 2000) , y otros animales con inclusión de ratones (Svoboda et al., 2000; Wianny y Zernicka-Goetz, 2000) y 10 es probable que exista también en humanos. La RNAi está estrechamente ligada al mecanismo de co-supresión postranscripcional para silenciación de genes (PTGS) en plantas y extinción en hongos (Catalanotto et al., 2000; Cogoni y Macino, 1999; Dalmay et al., 2000; Ketting y Plasterk, 2000; Mourrain et al., 2000; Smardon et al., 2000) y algunos componentes de la maquinaria de la RNAi son necesarios también para silenciación postranscripcional por co-supresión (Catalanotto et al., 2000; Dernburg et al., 2000; Ketting y Plasterk, 2000) . El tópico ha sido revisado también recientemente (Bass, 2000; Bosher y Labouesse, 2000; Fire, 1999; Plasterk y Ketting, 2000; Sharp, 1999; Sijen y Kooter, 2000) , véase también el ejemplar completo de Plant Molecular Biology, vol. 43, número 2/3, (2000) .

En las plantas, además de PTGS, los transgenes introducidos pueden conducir también a silenciación transcripcional de genes por metilación del DNA dirigida por RNA de citosinas (véanse referencias en Wassenegger, 2000) . Dianas genómicas tan cortas como 30 pb están metiladas en plantas de manera dirigida por RNA (Pelissier,

2000) . La metilación del DNA está presente también en mamíferos.

La función natural de RNAi y la co-supresión parece ser la protección del genoma contra la invasión por elementos genéticos móviles tales como retrotransposones y virus que producen RNA o dsRNA aberrante en la célula hospedadora cuando se vuelven activos (Jensen et al., 1999; Ketting et al., 1999; Ratcliff et al., 1999; Tabara et al., 1999) . La degradación específica del mRNA evita la replicación de transposones y virus, aunque algunos virus son capaces de contrarrestar o evitar este proceso por expresión de proteínas que suprimen la PTGS (Lucy et al., 2000; Voinnet et al., 2000) .

El dsRNA desencadena la degradación específica de RNAs homólogos únicamente dentro de la región de identidad con el dsRNA (Zamore et al., 2000) . El dsRNA se procesa a fragmentos de RNA de 21-23 nt y los sitios de escisión del RNA diana están distanciados regularmente con una separación de 21-23 nt. Por esta razón se ha sugerido que 30 los fragmentos de 21-23 nt son los RNAs guía para reconocimiento de la diana (Zamore et al., 2000) . Estos RNAs cortos fueron detectados también en extractos preparados a partir de células Schneider 2 de D. melanogaster que se transfectaron con dsRNA antes de la lisis celular (Hammond et al., 2000) ; sin embargo, las fracciones que exhibían actividad de nucleasa específica de la secuencia contenían también una gran fracción de dsRNA residual. El papel de los fragmentos de 21-23 nt en el guiamiento de la escisión de mRNA se ve respaldado adicionalmente por la observación de que fragmentos de 21-23 nt aislados de dsRNA procesado son capaces, en cierto grado, de mediar la degradación específica de mRNA (Zamore et al., 2000) . Moléculas de RNA de tamaño similar se acumulan también en tejido vegetal que exhibe PTGS (Hamilton y Baulcombe, 1999) .

En este caso, los inventores utilizan el sistema establecido de Drosophila in vitro (Tuschl et al., 1999; Zamore et al., 2000) para explorar adicionalmente el mecanismo de la RNAi. Se demuestra que RNAs cortos de 21 y 22 nt, cuando 40 están apareados en bases con extremos 3' colgantes, actúan como los RNAs guía para degradación del mRNA específica de la secuencia. Los dsRNAs cortos de 30 pb son incapaces de mediar la RNAi en este sistema debido a que ya no se procesan a RNAs de 21 y 22 nt. Adicionalmente, se definieron los sitios de escisión de RNA diana con relación a los RNAs de interferencia cortos de 21 y 22 nt (siRNAs) y aportan evidencia de que la dirección de procesamiento del dsRNA determina si un RNA diana sentido o antisentido puede ser escindido por el complejo 45 siRNA-endonucleasa producido. Adicionalmente, los siRNAs pueden ser también instrumentos importantes para modulación de la transcripción, v.g. silenciación de genes de mamífero por guiamiento de la metilación del DNA.

Experimentos adicionales en sistemas de cultivo de células humanas in vivo (células HeLa) demuestran que moléculas de RNA bicatenario que tienen preferiblemente una longitud de 19-25 nucleótidos tienen actividad de RNAi. Así, en contraste con los resultados de Drosophila, también moléculas de RNA bicatenario de 24 y 25 nt de 50 longitud son eficientes para la RNAi.

WO 00/44895 da a conocer el uso médico de dsRNA.

El objeto subyacente de la presente invención es proporcionar nuevos agentes capaces de mediar la Interferencia de RNA específica de la diana u otras modificaciones de ácido nucleico específicas de la diana tales como metilación del DNA, teniendo dichos agentes eficacia y seguridad mejoradas comparados con agentes de la técnica 55 anterior.

La solución de este problema se proporciona por una molécula de RNA bicatenario aislada en la forma de dos cadenas de RNA separadas, en donde cada cadena de RNA tiene una longitud de 19-23 nucleótidos, en donde dicha molécula de RNA es capaz de interferencia de RNA, en donde la molécula de RNA contiene al menos un análogo de nucleótido modificado, para uso en medicina. Preferiblemente, al menos una cadena tiene un colgante 3' de 1-3 nucleótidos y preferiblemente 2 nucleótidos. La otra cadena puede tener extremos romos o tiene un colgante 3' de hasta 6 nucleótidos. Asimismo, si ambas cadenas del dsRNA son exactamente de 21 ó 22 nt, es posible observar cierta interferencia del RNA cuando ambos extremos son romos (colgante de 0 nt) . La molécula de RNA es preferiblemente una molécula de RNA sintética que está sustancialmente exenta de contaminantes existentes en extracto de células, v.g. de embrión de Drosophila. Adicionalmente, la molécula de RNA está con preferencia sustancialmente exenta de cualesquiera contaminantes no específicos de la diana, particularmente moléculas de RNA no específicas de la diana, v.g., de contaminantes existentes en extractos de células.

Sorprendentemente, se encontró que moléculas de RNA bicatenario sintético corto, particularmente con extremos 3' colgantes son mediadores específicos de secuencia de RNAi y median la escisión eficiente del RNA diana, en donde el sitio de escisión está localizado cerca del centro de la región abarcada por el RNA guía corto.

Preferiblemente, cada cadena de la molécula de RNA tiene una longitud de 20-22 nucleótidos (o 20-25 nucleótidos en células de mamífero) , en donde la longitud de cada cadena puede ser igual o diferente. Con preferencia, la longitud del colgante 3' alcanza de 1 a 3 nucleótidos, en donde la longitud del colgante puede ser igual o diferente para cada cadena. Las cadenas de RNA tienen preferiblemente grupos hidroxilo 3'. El término 5' comprende preferiblemente un grupo fosfato, difosfato, trifosfato o hidroxilo. Los dsRNAs más eficaces están compuestos de dos cadenas de 21 nt que están apareadas de tal modo que están presentes colgantes 3' de 1-3, particularmente 2 nt en ambos extremos del dsRNA.

La reacción de escisión del RNA diana guiada por siRNAs es altamente específica de la secuencia. Sin embargo, no todas las posiciones de un siRNA contribuyen por igual al reconocimiento de la diana. Los desapareamientos en el centro del dúplex de siRNA son sumamente críticos y anulan esencialmente la escisión del RNA diana. En contraste, el nucleótido 3' de la cadena de siRNA (v.g. la posición 21) que es complementario al RNA diana monocatenario, no contribuye a la especificidad del reconocimiento de la diana. Adicionalmente, la secuencia del colgante 3' de 2 nt no apareado de la cadena de siRNA con la misma polaridad que el RNA diana no es crítica para la escisión del RNA diana, dado que sólo la cadena de siRNA antisentido guía el reconocimiento de la diana. Por tanto, a partir de los nucleótidos colgantes monocatenarios únicamente la posición penúltima del siRNA antisentido (v.g. posición 20) tiene que coincidir con el mRNA sentido direccionado.

Sorprendentemente,... [Seguir leyendo]

1. Molécula de RNA bicatenario aislada en la forma de dos cadenas de RNA separadas, en donde cada cadena de RNA tiene una longitud de 19-23 nucleótidos, en donde dicha molécula de RNA es capaz de interferencia de RNA, en donde la molécula de RNA contiene al menos un análogo de nucleótido modificado, para uso en medicina.

2. La molécula de RNA para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde al menos una cadena tiene un colgante 3' de 1-3 nucleótidos.

3. La molécula de RNA para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde cada cadena tiene una longitud d.

2. 22 nucleótidos.

4. La molécula de RNA para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-3, en donde el 10 colgante 3' está estabilizado contra la degradación.

5. La molécula de RNA para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el análogo de nucleótido modificado se selecciona de ribonucleótidos modificados en el azúcar o en la cadena principal.

6. La molécula de RNA para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el

análogo de nucleótido es un ribonucleótido modificado en el azúcar, en donde el grup.

2. OH está reemplazado por un grupo seleccionado de H, OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2 o CN, en donde R es C1-C6 alquilo, alquenilo o alquinilo y halo es F, Cl, Br o I.

7. La molécula de RNA para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el análogo de nucleótido es un ribonucleótido modificado en la cadena principal, que contiene un grupo fosfotioato.

8. La molécula de RNA para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que tiene una secuencia que tiene una identidad de al menos 70% con una molécula diana de mRNA predeterminada.

9. La molécula de RNA para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde las cadenas de RNA se sintetizan química o enzimáticamente.

10. La molécula de RNA para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para administración 25 por suministro mediado por portador o inyección.

11. La molécula de RNA para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 dirigida contra un gen en un mamífero, particularmente un humano.

12. La molécula de RNA para uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el gen está asociado con una afección patológica.

13. La molécula de RNA para uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el gen es un gen asociado a un patógeno, preferiblemente un gen viral, o en donde el gen es un gen asociado a un tumor o en donde el gen es un gen asociado a una enfermedad autoinmune.

14. La molécula de RNA para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde el uso es en medicina humana.

15. Composición farmacéutica que contiene como agente activo al menos una molécula de RNA bicatenario de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14 y un portador farmacéutico.

16. La composición de la reivindicación 15, para uso en aplicaciones diagnósticas in vivo.

17. La composición de la reivindicación 15, para uso en aplicaciones terapéuticas.

FIGURA 1A

FIGURA 2

pb tiempo (h)

diana sentido diana antisentido

FIGURA 3A

FIGURA 3B

diana sentido diana antisentido

FIGURA 4A

pb

pb

111 pb

FIGURA 4B

FIGURA 5A

FIGURA 6A

Fig. 11 Parte III

FIGURA 16

FIGURA 18

Pp–luc/Rr–luc norm.