Un péptido que comprende una secuencia seleccionada de Ciso-DGRCVSGCAGRC,

GisoDGRG, Ci-soDGRC, CisoDGRCG, LQCICTGisoDGRGEWKCE, LQCISTG-isoDGRGEWKCE, CICTGisoDGRGEWKC, CISTGi-soDGRGEWKC, MRCTCVGisoDGRGEWTCY, MRCTSVGisoDGRGEWTCY, CTCVG-isoDGRGEWTC o CTSVGisoDGRGEWTC, en donde isoD es ácido isoaspártico.

Producto de conjugación.

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a nuevos péptidos que pueden utilizarse en el tratamiento de enfermedades asociadas con angiogénesis y cáncer. Más particularmente, la invención se refiere a péptidos de la matriz extracelular y derivados de los mismos, y, en particular, a péptidos que comprenden un resto DGR e isómeros de los mismos. La presente invención se refiere también a citoquinas modificadas, en particular a derivados de citoquinas capaces de "alojar" los vasos angiogénicos.

Antecedentes de la Invención

La matriz extracelular es un regulador importante del comportamiento de células y tejidos. Las proteínas de la matriz extracelular, tales como fibronectina, vitronectina, colágenos y laminina se fijan a cierto número de receptores celulares que controlan muchos fenómenos biológicos médicamente importantes, tales como angiogénesis, migración celular, reparación tisular, diferenciación de las células del cáncer, agregación plaquetaria y regreso de células del sistema inmunitario y procesos neuronales a sus sitios diana. Una familia importante de receptores que se fijan a la matriz extracelular son las integrinas.

Las fibronectinas son grandes glicoproteínas de la matriz extracelular (~ 450 KDa) que han sido implicadas en la fijación de integrinas. Las mismas se componen de dos subunidades prácticamente idénticas unidas por disulfuro, estando constituida cada subunidad por tres tipos de módulos homólogos que se repiten denominados repeticiones FN-I, FN-II y FN-III. Adicionalmente, pueden estar presentes también módulos empalmados alternativamente, denominados EDA, EDB y IIICS (Mohri, 1997; Pankov y Yamada, 2002) . Módulos individuales o grupos de módulos pueden contener sitios de fijación para moléculas diferentes, que incluyen glucosaminoglucanos sulfatados, DNA, gelatina, heparina y fibrina (Mohri, 1997; Pankov y Yamada, 2002; Yamada, 1989) . Adicionalmente, las fibronectinas contienen sitios de fijación para aproximadamente la mitad de los receptores de integrinas conocidos de la superficie celular (Johansson et al., 1997; Plow et al., 2000) . En particular, la repetición FN-III10 contiene un sitio RGD que puede fijar las integrinas α3β1, α5β1, αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6, α8β1 y αllbβ3, mientras que la repetición FN-III9 contiene el denominado "sitio de sinergia" PHSRN que coopera con RGD en la fijación de α5β1 y aIIbβ3 (Busk et al., 1992; Dedhar y Gray, 1990; Gardner y Hynes, 1985; Johansson et al., 1997; Pankov y Yamada, 2002; Plow et al., 1985; Pytela et al., 1985; Smith et al., 1990; Takada et al., 1987; Vogel et al., 1990; Weinacker et al., 1994) . La región FN-III14-IIICS contiene tres sitios (denominados CS1, CS5 y H1) caracterizados por la presencia de un resto LDV y sitios accesorios REDV e IDA implicados en el reconocimiento de α4β1 y α4β7 (Johansson et al., 1997; Pankov y Yamada, 2002) . Además, la repetición FN-III5 contiene la secuencia KLDAPT que fija α4β1 y α4β7 (Moyano et al., 1997) , mientras que FN-I1-9 y FN-II1-2 contienen sitios, no identificados todavía, que pueden interaccionar con α5β1 (Hocking et al., 1998) .

El análisis de la estructura primaria y terciaria de la fibronectina humana demostró que esta proteína contiene dos bucles GNGRG, localizados en módulos FN-I5 y FN-I7, que están conservados en bovinos, murinos, ratas, anfibios y peces (Di Matteo et al.) . Dos sitios NGR adicionales, menos conservados, están presentes también en FN-II1 y FN-III9 humanos. Un trabajo experimental reciente ha demostrado que los péptidos que contienen el resto NGR pueden inhibir la adhesión celular mediada por α5β1 y αvβ1 a la fibronectina (Koivunen et al., 1993) .

La interacción entre las integrinas ancladas a la superficie celular y los componentes de la matriz extracelular ha sido implicada en la angiogénesis, un proceso importante en el crecimiento neonatal y en la patogénesis de una gran diversidad de enfermedades clínicas que incluyen inflamación tisular, artritis, crecimiento de tumores, retinopatía diabética, degeneración macular por neovascularización de la retina y condiciones análogas. Es sabido que la integrina αvβ3, el receptor de vitronectina, juega un papel crítico en la angiogénesis (Hynes, 2002) . Es sabido que los compuestos capaces de inhibir la interacción de esta integrina con las proteínas de la matriz extracelular inhiben la angiogénesis y el crecimiento tumoral (Brooks et al., 1994; Brooks et al., 1995; Friedlander et al., 1995; Friedlander et al., 1996; Harnmes et al., 1996) . Sin embargo, un problema asociado con estos inhibidores es su reactividad cruzada con muchas especies de integrinas.

En vista del conocimiento creciente del papel de la matriz extracelular en los procesos biológicos y el desarrollo de enfermedades, persiste una necesidad de nuevas terapéuticas que estén enfocadas a esta área. La presente invención aborda esta necesidad.

La actividad antitumoral de algunas citoquinas está perfectamente conocida y descrita. Algunas citoquinas han sido utilizadas ya terapéuticamente también en humanos (Fiers et al., 1995) . Por ejemplo, citoquinas tales como interleuquina-2 (IL-2) e interferón α (IFNα) han demostrado actividad antitumoral positiva en pacientes con diferentes tipos de tumores, tales como el carcinoma metastásico de riñón, la leucemia de células vellosas, el sarcoma de Kaposi, el melanoma, el mieloma múltiple, y análogos. Otras citoquinas como IFNβ, el Factor de Necrosis Tumoral (TNF) α, TNFβ, IL-1, 4, 6, 12, 15 y los Factores Estimulantes de colonias (CFSs) han demostrado cierta actividad antitumoral sobre algunos tipos de tumores y por esta razón son objeto de estudios adicionales.

En general, el uso terapéutico de citoquinas se ve muy limitado por su toxicidad sistémica. TNF, por ejemplo, se descubrió originalmente por su capacidad para inducir la necrosis hemorrágica de algunos tumores (Carswell et al., 1975) , y por su efecto citotóxico in vitro sobre diferentes líneas tumorales (Helson et al., 1975) , pero se demostró posteriormente que tiene actividad pro-inflamatoria fuerte, que puede, en caso de condiciones de superproducción, afectar peligrosamente al cuerpo humano (Tracey et al., 1993) .

Dado que la toxicidad sistémica es un problema fundamental con el uso de cantidades farmacológicamente activas de citoquinas en humanos, nuevos derivados y estrategias terapéuticas se encuentran actualmente bajo evaluación, orientados a reducir los efectos tóxicos de esta clase de efectores biológicos al tiempo que mantienen su eficacia terapéutica. Por ejemplo, WO 01/61017 describe un producto de conjugación entre TNF o IFNγ y un ligando del receptor CD13; WO 03/093478 describe una composición farmacéutica que comprende un conjugado de una citoquina y un resto direccionado a tumores en la cual la citoquina está presente en una cantidad que no induce un mecanismo de realimentación negativo; y WO 03/092737 describe conjugados de diversas citoquinas y restos direccionados a tumores. La presente invención proporciona nuevos conjugados de citoquinas que tienen potencial terapéutico.

Sumario de la Invención

La desamidación de la asparagina (N) , una modificación no enzimática posterior a la traducción de las proteínas, está considerada generalmente como un evento deletéreo asociado con el envejecimiento de las proteínas. En la presente solicitud se demuestra que una secuencia Asparagina-Glicina-Arginina (NGR) de la matriz extracelular puede promover la adhesión de las células endoteliales por un mecanismo inusual basado en la desamidación no enzimática de asparagina a ácido aspártico y ácido isoaspártico, generando un nuevo resto de adhesión celular. En particular, se demuestra que esta desamidación está asociada con una "ganancia de función"; siendo los fragmentos desamidados capaces de inhibir la adhesión de las células endoteliales a la vitronectina, inhibir la integrina αvβ3 e inhibir el crecimiento tumoral.

En particular, se ha demostrado que los isómeros LisoDGR y DDGR exhiben fijación de la adhesión celular y propiedades anti-cáncer mejoradas sobre otras formas isómeras. Esto es sorprendente, dado que la gran mayoría de los péptidos comprenderán el enantiómero L de ácido aspártico. Los péptidos producidos por expresión génica comprenderán todos ellos... [Seguir leyendo]

1. Un péptido que comprende una secuencia seleccionada de Ciso-DGRCVSGCAGRC, GisoDGRG, CisoDGRC, CisoDGRCG, LQCICTGisoDGRGEWKCE, LQCISTG-isoDGRGEWKCE, CICTGisoDGRGEWKC, CISTGisoDGRGEWKC, MRCTCVGisoDGRGEWTCY, MRCTSVGisoDGRGEWTCY, CTCVG-isoDGRGEWTC o CTSVGisoDGRGEWTC, en donde isoD es ácido isoaspártico.

2. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el péptido comprende CisoDGRC lineal, CisoDGRC cíclico, CisoDGRCG lineal o CisoDGRCG cíclico.

3. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde isoDGR es LisoDGR.

4. Un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el péptido comprende una vuelta que implica los residuos G y R del resto isoDGR.

5. Un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el péptido comprende hasta 350 aminoácidos.

6. Un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores distinto del que se forma por metabolismo de un péptido que comprende el resto NGR.

7. Un producto de conjugación que comprende un péptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un fármaco, citoquina, fragmento de citoquina, toxina, péptido apoptótico, modificador de la respuesta biológica, radionucleido, partícula viral, gen o un compuesto de producción de imágenes.

8. Un producto de conjugación de acuerdo con la reivindicación 7 que comprende un péptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y una citoquina.

9. Un producto de conjugación de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la citoquina está derivatizada con polietilenglicol o un residuo acilo.

10. Un producto de conjugación de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, en donde la citoquina está enlazada al péptido por un espaciador.

11. Un producto de conjugación de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el espaciador es una glicina (G) .

12. Un producto de conjugación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en donde la citoquina es TNF, IFNγ, IL-12, IP-10, IL-7 o EMAP II.

13. Un producto de conjugación de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la citoquina es TNF o IFNγ.

14. Un producto de conjugación de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la citoquina es TNF.

15. Un producto de conjugación de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la citoquina es TNFα o TNFβ.

16. Una composición farmacéutica que comprende un péptido o producto de conjugación como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

17. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un producto de conjugación como se

define en la reivindicación 14 ó 15, y una cantidad eficaz de IFNγ o un polinucleótido que codifica el mismo.

18. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 16 ó 17, en la forma de una solución o suspensión inyectable o un líquido para infusiones.

19. Una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en la forma de liposomas.

20. Una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, que comprende adicionalmente un agente antitumoral o un compuesto de producción de imágenes de tumores de diagnóstico.

21. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el otro agente antitumoral es doxorrubicina, melfalán, cis-platino, gemcitabina o taxol.

22. Una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21 que no comprende esencialmente péptido o conjugado alguno que tenga un resto NGR correspondiente.

23. Uso del péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el producto de conjugación de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de osteoporosis, artritis, retinopatía diabética, degeneración macular, restenosis o hemangioma.

24. Uso del péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el producto de conjugación de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22 para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

25. Uso de acuerdo con la reivindicación 24, en donde el cáncer comprende un tumor sólido.

26. El péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el producto de conjugación de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22 para uso en el tratamiento de osteoporosis, artritis, retinopatía diabética, degeneración macular, restenosis o hemangioma.

27. El péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el producto de conjugación de una cualquiera de

las reivindicaciones 7 a 15, o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22 para uso en el tratamiento del cáncer.

28. El péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el producto de conjugación de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22 para uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la reivindicación 27, en donde el cáncer comprende un tumor sóli

do.