PREPARACIÓN DE CÉLULAS.

Un método para transducción de células con un constructo genético y selección de células genéticamente modificadas,

caracterizado por comprender el método el llevar a cabo la transducción y selección en un sistema cerrado, en donde las células se lavan, se concentran, se transducen y se resuspenden utilizando un dispositivo de manipulación automático de fluidos sin transferencia manual alguna de fluidos, y en donde el método comprende selección inmunomagnética de las células transducidas.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/IB2005/001565.

Solicitante: MOLMED SPA.

Nacionalidad solicitante: Italia.

Dirección: VIA OLGETTINA 58 20132 MILAN ITALIA.

Inventor/es: TOMA, SALVATORE, BENATI,Claudia, SCIARRETTA BIROLO,Roberto, LA SETA CATAMANCIO,Simona, RADRIZZANI,Marina, SENDRESEN,Cecilia.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 5 de Mayo de 2005.

Clasificación PCT:

  • C12N15/867 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Vectores retrovirales.

Clasificación antigua:

  • C12N15/867 C12N 15/00 […] › Vectores retrovirales.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania.

PDF original: ES-2366337_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Objeto de la invención

La presente invención se refiere a métodos para transducción y selección de células genéticamente modificadas en un sistema cerrado.

Antecedentes de la invención

En la actualidad se utiliza usualmente un sistema abierto para la transducción y selección de células genéticamente modificadas. Sin embargo, tales sistemas pueden consumir mucho tiempo y pueden estar asociados con riesgos decontaminación importantes. Éste es particularmente el caso cuando las células deben utilizarse en un escenario clínico y cuando se requieren dosis elevadas. Un ejemplo de un requisito de este tipo es la producción de células T donantes para uso en trasplante alogénico de médula ósea.

El trasplante alogénico de médula ósea es el tratamiento de elección para muchas enfermedades hematológicas malignas (Thomas 1983, J Clin Oncol 1:517; O'Reilly 1993, Curr Op In Hematol 221).

En el contexto del trasplante alogénico de médula ósea, el papel inmunológico de los linfocitos T donantes en la erradicación frecuentemente completa del tumor está reconocido universalmente. El efecto antitumoral derivado de los linfocitos T donantes (Injerto-versus-Leucemia, GvL) hace que este método terapéutico sea superior a la quimioterapia y el trasplante autólogo convencionales.

Además, la infusión de linfocitos T donantes es capaz también de mediar la reconstitución de respuestas inmunes contra virus y hongos, lo que se demuestra por la menor incidencia y gravedad de dichas infecciones en el contexto del trasplante no manipulado frente a aquéllos que se han empobrecido en linfocitos T (Papadopoulos 1994, N Engl J Med 330:1185; Rooney 1995, The Lancet 345:9; Heslop 1996, Nature Med 2:551; Rooney 1998, Blood 92: 1549; Riddel 1992, Science 257; Walter 1995, N Engl J Med 333:1038).

Frente a un beneficio clínico claro en la inducción de un efecto antitumoral, la infusión de linfocitos T donantes se ve todavía complicada por un riesgo elevado del desarrollo de la enfermedad del injerto frente al hospedador (GvHD). Esto es debido a la agresión contra los tejidos del hospedador por los linfocitos del donante y se caracteriza por muerte y morbilidad elevadas, especialmente en pacientes que reciben el trasplante de un donante emparentado haploidéntico (Kolb 1995, Blood 86:2041; Collins 1997, J Clin Oncol 15:433; Porter 2000, Blood 95:1214).

La incidencia y gravedad de la enfermedad es proporcional al número de linfocitos infundidos, lo que significa que cuanto mayor es la dosis tanto más grave es la enfermedad. Dado que el beneficio clínico en términos de actividad antitumoral y antiviral es proporcional a la dosis de infusión, el aumento de la dosis aumenta el beneficio antitumoral pero aumenta al mismo tiempo el riesgo de GvHD. No existe un tratamiento específico para la GvHD y las terapias en uso, basadas en esteroides y otros inmunosupresores, son inespecíficas y se ven complicadas por una incidencia elevada de infecciones graves y recaída de la enfermedad.

Con objeto de lograr una reconstitución inmunológica y reducir la incidencia de sucesos infecciosos y recaída de la enfermedad en tanto que se es capaz de controlar selectivamente la GvHD emergente, una estrategia prometedora es el uso de linfocitos donantes que han sido transducidos con un vector retroviral que contiene genes suicidas y marcadores. El gen suicida hace que las células genéticamente modificadas sean sensibles a un fármaco que se utilizará más tarde para eliminar selectivamente las células infundidas en caso de GvHD emergente. La presencia de un gen marcador permite el seguimiento de la supervivencia, expansión y sitios de migración de las células genéticamente modificadas.

Por ejemplo, puede utilizarse el vector SFCMM-3, que lleva a la vez el gen suicida HSV-tk y el gen marcador ALNGFR (Verzeletti 98, Human Gene Therapy 9:2243). HSV-tk codifica la enzima timidina-quinasa del Virus del Herpes Simplex I (HSV-tk) que, una vez insertado en los linfocitos donantes, hace que los mismos sean selectivamente sensibles a ganciclovir. El fármaco ganciclovir, después de administración al paciente, es fosforilado por la enzima timidina-quinasa expresada por las células genéticamente modificadas y luego sucesivamente por quinasas celulares. La forma activa de ganciclovir inhibe la síntesis de DNA genómico, causando de este modo la muerte celular (Smee 1983, Antimicrobials Agents and Chemotherapy 4:504). El sistema suicida HSV-tk ha demostrado ya ser eficiente en diversos estudios clínicos (Bordignon 1995, Hum Gene Ther 2:813; Bonini 1997, Science 276:1719; Tiberghien 1997, Hum Gene Ther 8:615; Tiberghien 2001, Blood 97:63; Link 1998, Hum Gene Ther 9:115; Champlin 1999, Blood 94:1448).

El gen LNGFR codifica el receptor de afinidad baja para el factor de crecimiento de los nervios (NGF) que ha sido delecionado en la porción intracelular de tal modo que ya no es capaz de transmitir señales (ALNGFR) (Mavilio 1994, Blood 83:1988). Utilizando anticuerpos monoclonales y cuentas magnéticas, la presencia de la proteína ALNGFR permite la inmunoselección in vitro de las células genéticamente modificadas. Además, la expresión de la proteína ALNGFR se utiliza como marcador para las células genéticamente modificadas una vez infundidas al paciente para permitir la documentación de la presencia, expansión o reducción de dichas células y para su caracterización en términos de subtipos de linfocitos y estado de activación.

**(Ver fórmula)**

Los estudios clínicos arriba indicados (Bordignon 1995, Hum Gene Ther 2:813; Bonini 1997, Science 276:1719; Tiberghien 1997, Hum Gene Ther 8:615; Tiberghien 2001, Blood 97:63; Link 1998, Hum Gene Ther 9:115; Champlin 1999, Blood 94:1448) están basados en métodos diferentes para la producción de linfocitos modificados genéticamente (el producto final). Los métodos incluyen la descongelación, estimulación, transducción, selección y expansión de las células y la recuperación del producto final para infusión al paciente. La seguridad del producto final, testada antes de la infusión al paciente, está relacionada con la manipulación de las células durante cada paso del proceso. Usualmente, estos métodos se desarrollan en sistemas abiertos utilizando matraces para cultivo de las células y cabinas de flujo laminar para las manipulaciones de células tales como transducción y selección. Actualmente se utiliza un sistema abierto para producción de las células T transducidas para protocolos clínicos. Sin embargo, un sistema de este tipo puede consumir mucho tiempo y puede estar asociado con riesgos importantes de contaminación. Por consiguiente, existe necesidad de un método eficiente y seguro de transducción y selección de las células genéticamente modificadas.

Resumen de la invención

La presente invención resuelve el problema mencionado anteriormente por proporcionar un método para manipulación y cultivo de las células en un sistema cerrado. La transformación de un sistema abierto a un sistema cerrado permite la escalación del producto y la mejora de la seguridad del producto para uso clínico.

En un aspecto de la presente invención se proporciona un método para transducción de células con un constructo genético y selección de células genéticamente modificadas, comprendiendo el método realizar la transducción y selección en un sistema cerrado, en donde las células se lavan, concentran, transducen y resuspenden utilizando un dispositivo automático de tratamiento de fluidos sin transferencia manual alguna de los fluidos, y en donde el método comprende la selección inmunomagnética de las células transducidas.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un método de modificación de células, que comprende:

(i) la descongelación opcional de dichas células;

(ii) la estimulación opcional de dichas células;

(iii) la transducción de dichas células con un constructo genético;

(iv) la selección de las células transducidas;

(v) la expansión opcional y cosecha de dichas células transducidas;

(vi) en donde los pasos (i) a (v) se realizan en un sistema cerrado, y en donde el paso (iv) comprende la selección inmunomagnética de las células transducidas; y

(vii) en donde las células se lavan, concentran, transducen y resuspenden utilizando un dispositivo automático de tratamiento de fluidos sin transferencia manual alguna de los fluidos, y en donde el método comprende la selección inmunomagnética de las células transducidas.

Un sistema cerrado... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para transducción de células con un constructo genético y selección de células genéticamente modificadas, caracterizado por comprender el método el llevar a cabo la transducción y selección en un sistema cerrado, en donde las células se lavan, se concentran, se transducen y se resuspenden utilizando un dispositivo de manipulación automático de fluidos sin transferencia manual alguna de fluidos, y en donde el método comprende selección inmunomagnética de las células transducidas.

2. Un método de modificación de células caracterizado porque comprende:

(i) la descongelación opcional de dichas células;

(ii) la estimulación opcional de dichas células;

(iii) la transducción de dichas células con un constructo genético;

(iv) la selección de las células transducidas;

(v) la expansión opcional y la cosecha de dichas células transducidas;

(vi) en el cual los pasos (i) a (v) se realizan en un sistema cerrado, y en el cual el paso (iv) comprende la selección inmunomagnética de las células transducidas; y

(vii) en el cual las células se lavan, concentran, transducen y resuspenden utilizando un dispositivo automático de tratamiento de fluidos sin transferencia manual alguna de los fluidos.

3. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en el mismo el constructo genético es un vector retroviral.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado por ser en el mismo el vector retroviral un vector derivado de MLV.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, caracterizado porque en el mismo el vector retroviral codifica un marcador de la superficie celular.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque en el mismo el marcador de la superficie celular es ΔLNGFR.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en el mismo las células son células T donantes.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en el mismo el método comprende un paso de transducción que utiliza fibronectina o una variante de la misma.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en el mismo el método comprende un paso de transducción utilizando el sistema RetroNectin®.

10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en el mismo el método utiliza un solo dispositivo.

11. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en el mismo el método utiliza dos o más dispositivos para concentración de las células, lavado de las células, transducción, cambio de medio y selección inmunomagnética de las células transducidas.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque en el mismo el método utiliza

(i) un primer dispositivo para concentración de las células, lavado de las células, transducción y cambio de medio; y

(ii) un segundo dispositivo para selección inmunomagnética de las células transducidas.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, caracterizado porque en el mismo la transferencia de las células entre los dispositivos se lleva a cabo utilizando bolsas selladas y conexiones asépticas.

14. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque en el mismo una membrana rotativa asegura la filtración de las células, contra una circulación de tampón en contracorriente, y está conectada a diferentes bolsas, en un sistema totalmente cerrado que permite programación paso a paso definible por el usuario.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque en el mismo (i) se realiza utilizando un Sistema de Procesamiento de Células CytoMate™ o una variante del mismo.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque en el mismo (ii) se realiza utilizando un Sistema Magnético de Separación de Células Isolex™ 300 o una variante del mismo.

 

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