Producción estable de vectores lentivirales.

Un método para obtener una línea celular de empaquetamiento lentiviral estable que comprende:

i. preparar un vector híbrido (A) que comprende un esqueleto baculoviral que contiene un casete de integración flanqueado por ITR de AAV que incluye dos casetes de expresión, en el que el primer casete de expresión codifica los genes gag y pol lentivirales y el segundo rev lentiviral, y un marcador de selección con antibiótico y

ii. preparar un plásmido de expresión (B) que contiene un marco de lectura abierto de rep de AAV bajo el control de un promotor

iii. transfectar las células con el plásmido de expresión B y posteriormente infectar las células con el vector híbrido A

iv. cultivar las células en presencia de antibiótico para la selección

v. obtener células que expresan de manera estable las proteínas gag, pol y rev

vi. integrar un gen env en las células mediante el uso de un vector de expresión

vii. cultivar las células para obtener una línea celular que expresa de manera estable las proteínas gag, pol, rev y env.

Producción estable de vectores lentivirales Campo de la invención La presente invención se refiere a la producción de vectores lentivirales (LV) para terapia génica. Más en particular, la invención se refiere a líneas celulares estables de empaquetamiento lentiviral y a métodos de fabricación de las líneas celulares de empaquetamiento mediante el uso de un vector baculo-virus adenoasociado (AAV) híbrido para la integración estable de las proteínas lentivirales estructurales y reguladoras.

Antecedentes Desde el primer ensayo clínico de fase I de LV contra el SIDA en 2001, han sido examinados detalladamente por las autoridades 38 ensayos de fase I-II y dos ensayos de fase II-III que aprovechan LV basados en HIV como vehículos de administración génica; tres de ellos todavía están bajo revisión. La mayoría de ensayos comprenden trastornos monogénicos, algunos de los cuales tienen una gran incidencia, tales como la anemia de Cooley, β-talasemia mayor (4 ensayos) . Le siguen el cáncer y las enfermedades infecciosas, principalmente la infección por HIV-1. Normalmente, el número de pacientes inscritos en los ensayos de fase I/II es limitado, pero no en los ensayos de fase III. Así, las líneas celulares de empaquetamiento estables para la 2a (basadas en LTR) y 3a (basadas en SIN) generación de LV son necesarias urgentemente para hacer frente a la demanda de producción a gran escala de LV para los ensayos de fase III, que se espera alcanzar en mayor número en el futuro. La producción de LV basada en protocolos transitorios es poco práctica, de hecho, para la aplicación global desde un punto de vista de seguridad, coste y reproducibilidad.

Un gran conjunto de pruebas indica que los LV, los vectores de integración viral desarrollados más recientemente para la terapia génica, son aplicables en general para transducir células diferenciadas de manera terminal o cíclicas, ideales para mantener la expresión del transgén a largo plazo y más seguras de lo que se temió inicialmente. La experiencia acumulada con vectores gamma-retrovirales (γRV) del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV) a lo largo de las últimas dos décadas dirigió el progreso rápido del sistema de administración de LV, cuyo desarrollo se originó por la necesidad de superar la incapacidad de los retrovirus de transducirse en células que no están en división. En particular, la generación de vectores de transferencia auto-inactivantes (SIN) hace que la posibilidad del uso generalizado de LV en ensayos clínicos humanos sea más factible [1] y proporciona una expansión y optimización de un proceso de fabricación muy eficaz. Sin embargo, en contraste con γRV, que se pueden producir mediante varias líneas celulares humanas y murinas de empaquetamiento disponibles comercialmente, los LV se producen actualmente no solamente para grado de investigación, sino también para grado GMP, casi exclusivamente mediante transfección transitoria. Esta tecnología es cara, difícil de estandarizar y aumentar de escala, y requiere numerosos ensayos de validación posteriores. Además, el riesgo de lentivirus competentes de replicación (RCL) , que surgen posiblemente por medio de la recombinación entre secuencias virales en las construcciones de vectores de empaquetamiento y transferencia, es un suceso poco frecuente, pero más probable durante la producción transitoria que durante la producción estable.

El desarrollo de una línea celular de empaquetamiento estable equivalente a la retroviral para LV resultó ser más lento y difícil porque, en contraposición a los gamma retrovirus, la expresión de las proteínas lentivirales, tales como env, proteasa, y ciertas proteínas secundarias es tóxica para las células humanas. Para superar este problema, los genes secundarios, presentes en las versiones muy tempranas de las células de empaquetamiento, se eliminaron más tarde en las últimas generaciones. Las líneas celulares de empaquetamiento de LV basadas en SIV y HIV de primera generación se obtuvieron de células adherentes Vero de mono, o COS, HeLa y HEK293 humanas [2-5], modificadas con genomas de lentivirus que portaban unas pocas modificaciones cruciales, tales como la eliminación de la señal de empaquetamiento. El gp120 env y la mayoría de los genes secundarios, de hecho, se mantuvieron. El título de LV resultante fue muy bajo [2-5], y de manera más importante, la posible aplicación de estos vectores se limitó necesariamente a células T CD4+ para las aproximaciones de terapia génica anti-SIDA. Más tarde, se sustituyó gp120 env con la glicoproteína derivada del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) , y se eliminaron todos los genes secundarios porque se demostró que eran prescindibles para una producción eficaz de LV. Para prevenir la toxicidad descrita también para VSV-G, su expresión se indujo de manera condicional mediante una diversidad de sistemas diferentes, tales como el Tet, ecdisona, rev y la combinación de Tet y cumato [20]. De forma similar, para reducir el efecto tóxico de la proteasa viral durante la selección de clones, se ha descrito la expresión condicional del gen gag-pol mediante el Tet y la combinación de los fármacos doxiciclina y cumato [7]. En todos estos sistemas se integraron los genes gag-pol, rev y env mediante la transfección transitoria de ADN plasmídico, seguido de la selección con fármacos y la clonación celular.

Una de las cuestiones cruciales para la implementación de una línea celular de empaquetamiento realmente estable es la elección de los mejores vehículos virales de administración génica. La mayoría de los investigadores integraron los genes gag-pol, rev y env mediante la transfección transitoria de ADN plasmídico, seguido de la selección con fármacos y la clonación celular [7-10]. Se sabe que esta tecnología sufre con el tiempo el silenciamiento génico y la pérdida de genes [11], lo que puede comprometer la estabilidad a largo plazo del clon de empaquetamiento.

Se han descrito vehículos alternativos de administración génica especialmente en STAR [12] y en las líneas celulares de empaquetamiento desarrolladas más recientemente GPRG-TL-20 [6] en las que los genes gag, pol, y rev se integraron en células HEK293T mediante vectores lanzadera de MLV. Se integraron de manera estable dos copias del gen gag-pol recodificado en STAR, mientras no hay disponible tal información para GPRG-TL-20 [6]. A diferencia de STAR, en el que se transfectó el gen env, en GPRG-TL-20 todos los genes virales restantes se introdujeron mediante SIN-MLV.

Existen varios sistemas que permiten la integración estable de un genoma exógeno en las células hospedadoras. Palombo et al., 1998 [13] describe un vector baculovirus-AAV híbrido para la integración específica en las células hospedadoras. Tal vector parece ser muy eficaz si incluye el gen rep en el mismo vector baculovirus-AAV híbrido. No se hace mención en esta referencia a la construcción de la presente invención, y aún menos la sugerencia de usar este tipo de sistema para la producción de LV.

A lo largo de prácticamente las últimas dos décadas, se han hecho varios intentos de generar líneas celulares de empaquetamiento de LV estables. A pesar de la diferente tecnología descrita, hasta ahora ninguna de estas líneas celulares de empaquetamiento se emplea en ensayos clínicos ni acapara el mercado todavía. Por lo tanto, existe la necesidad de sistemas nuevos para la producción a gran escala de LV que sean eficaces en cuanto a la capacidad de producción y que sean seguros, económicos y reproducibles.

Compendio de la invención La presente invención está relacionada con el campo de la producción de LV. Existen en desarrollo varios ensayos clínicos de terapia génica que emplean LV como vehículos de administración génica. En todos estos ensayos, la producción de LV se basa todavía en protocolos transitorios.

La presente invención proporciona una estrategia nueva para generar una línea celular de empaquetamiento basada en HIV-1. Tal estrategia se basa en el uso de un vector híbrido que comprende un esqueleto baculoviral que contiene un casete de integración flanqueado por ITRs de AAV, el denominado sistema híbrido baculo-AAV, en combinación con un plásmido que codifica una proteína rep. Este sistema permite obtener una integración estable de las proteínas estructurales de HIV-1 gag/pol y rev. El sistema de la presente invención incluye a) un vector híbrido baculo-AAV caracterizado porque contiene dos casetes de expresión, uno que codifica los genes gag y pol lentivirales, y el otro rev lentiviral, y un marcador de selección, y b) un plásmido que codifica una proteína rep. El sistema propuesto representa una manera nueva y ventajosa de administrar proteínas de HIV-1... [Seguir leyendo]

1. Un método para obtener una línea celular de empaquetamiento lentiviral estable que comprende:

i. preparar un vector híbrido (A) que comprende un esqueleto baculoviral que contiene un casete de integración flanqueado por ITR de AAV que incluye dos casetes de expresión, en el que el primer casete de expresión codifica los genes gag y pol lentivirales y el segundo rev lentiviral, y un marcador de selección con antibiótico y

ii. preparar un plásmido de expresión (B) que contiene un marco de lectura abierto de rep de AAV bajo el control de un promotor

iii. transfectar las células con el plásmido de expresión B y posteriormente infectar las células con el vector híbrido A

iv. cultivar las células en presencia de antibiótico para la selección

v. obtener células que expresan de manera estable las proteínas gag, pol y rev

vi. integrar un gen env en las células mediante el uso de un vector de expresión vii. cultivar las células para obtener una línea celular que expresa de manera estable las proteínas gag, pol, rev y env

2. Un método para obtener una línea celular de empaquetamiento lentiviral estable que comprende:

i. preparar un vector híbrido (A) que comprende un esqueleto baculoviral que contiene un casete de integración flanqueado por repeticiones terminales invertidas (ITRs) de virus adeno-asociado (AAV) que incluye dos casetes de expresión, en el que el primer casete de expresión codifica los genes gag y pol lentivirales y el segundo rev lentiviral y un marcador de selección con antibiótico, y

ii. preparar un plásmido de expresión (B) que contiene el ORF de rep de AAV bajo el control de un promotor

iii. transfectar las células con el plásmido de expresión B y posteriormente infectar la célula con el vector híbrido A

iv. cultivar las células en presencia de antibiótico para la selección

v. obtener células que expresan de manera estable las proteínas gag, pol y rev

vi. integrar un gen tat lentiviral en tales células mediante el uso de un vector de expresión vii. cultivar las células para obtener una línea celular que expresa de manera estable las proteínas gag, pol, rev y tat

viii. integrar un gen env en tales células mediante el uso de un vector de expresión ix. cultivar las células para obtener una línea celular que expresa de manera estable la proteína gag, pol, rev, tat y env

3. Un método según la reivindicación 1 ó 2, en el que los dos casetes de expresión del vector híbrido están orientados cola a cola y cada uno está controlado por un promotor constitutivo y porta una poli A

4. Un método según la reivindicación 3, en el que el promotor se selecciona de CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1α, SFFV, y RSV

5. Un método según la reivindicación 4, en el que el promotor es CMV IE

6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el marcador de selección se selecciona de los genes de resistencia a higromicina, kanamicina, neomicina o zeomicina.

7. Un método según la reivindicación 6, en el que el marcador de selección es el gen de resistencia a higromicina.

8. Un método según la reivindicación 1 ó 7, en el que el marcador de selección se clona en posición 3' respecto de un IRES.

9. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la proteína Rep de AAV es Rep78.

10. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el gen env se selecciona de env de MLV 4070, env de RD114, proteína de la cubierta quimérica RD114-TR, proteína de la cubierta quimérica RD114-pro, env de baculovirus GP64 o env de GALV o derivados de los mismos.

11. Un método según la reivindicación 10, en el que el gen env es el gen que codifica la proteína de la cubierta quimérica RD114-TR

12. Un método según la reivindicación 11, en el que la RD114-TR se integra mediante el uso de un vector lentiviral SIN que comprende un casete de expresión que contiene del extremo 5' al 3' un promotor CMV, el intrón de βglobina que contiene un elemento RRE en su secuencia y el ORF de RD114-TR.

13. Una línea celular de empaquetamiento lentiviral estable que contiene integrado de manera estable en su genoma:

i. al menos una copia de un casete de integración flanqueado por ITRs de AAV que incluye dos casetes de expresión, en el que el primer casete de expresión codifica los genes gag y pol lentivirales y el segundo rev lentiviral y un marcador de selección

ii. al menos una copia de un gen env

14. Una línea celular de empaquetamiento lentiviral estable según la reivindicación 13, en la que la célula contiene además el gen tat de HIV-1 integrado de manera estable en su genoma.

15. Una línea celular de empaquetamiento lentiviral estable según la reivindicación 13 ó 14, en la que la célula es una línea celular humana seleccionada de HEK293, HEK293-T, HEK293-SF, TE671, HT1080 o HeLa.

16. Una línea celular de empaquetamiento lentiviral estable según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en la que los dos casetes de expresión del casete de integración están orientados cola-a-cola, y cada uno está controlado por un promotor constitutivo y porta una poli A

17. Una línea celular de empaquetamiento lentiviral estable según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en la que el promotor se selecciona de CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1α, SFFV, y RSV

18. Una línea celular de empaquetamiento lentiviral estable según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en la que el marcador de selección se selecciona de los genes de resistencia a higromicina, kanamicina, neomicina o zeomicina.

19. Una línea celular de empaquetamiento lentiviral estable según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, en la que el gen env se selecciona de env de MLV 4070, env de RD114, proteína de la cubierta quimérica RD114-TR, proteína de la cubierta quimérica RD114-pro, env de baculovirus GP64 o env de GALV o derivados de los mismos.

20. Una línea celular de empaquetamiento lentiviral estable según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, en la que el gen env es el gen que codifica la proteína de la cubierta quimérica RD114-TR

21. Un método para producir vectores lentivirales que comprende:

i. Cultivar una línea celular de empaquetamiento lentiviral estable según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20

ii. Insertar en la línea celular de empaquetamiento estable un vector de transferencia

22. Una línea celular productora que contiene integrado de manera estable en su genoma:

i. al menos una copia de un casete de integración flanqueado por ITRs de AAV que incluye dos casetes de expresión, en el que el primer casete de expresión codifica los genes gag y pol lentivirales y el segundo rev lentiviral y un marcador de selección

ii. al menos una copia de un env

iii. un vector de transferencia

23. Una línea celular productora según la reivindicación 22, en la que la célula contiene además al menos una copia de un gen tat lentiviral integrado de manera estable en su genoma.

24. Una línea celular productora según la reivindicación 22 ó 23, en la que la célula es una línea celular humana seleccionada de HEK293, HEK293-T, HEK293-SF, TE671, HT1080 o HeLa.

25. Una línea celular productora según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en la que los dos casetes de expresión del vector híbrido están orientados cola-a-cola, y cada uno está controlado por un promotor constitutivo y porta una poli A

26. Una línea celular productora según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, en la que el promotor se selecciona de CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1α, SFFV, y RSV.

27. Una línea celular productora según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, en la que el marcador de selección se selecciona de los genes de resistencia a higromicina, kanamicina, neomicina o zeomicina.

28. Una línea celular productora según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27, en la que el gen env se

selecciona de env de MLV 4070, env de RD114, proteína de la cubierta quimérica RD114-TR, proteína de la cubierta 5 quimérica RD114-pro, env de baculovirus GP64 o env de GALV o derivados de los mismos.

29. Una línea celular productora según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28, en la que el gen env es el gen que codifica la proteína de la cubierta quimérica RD114-TR.

30. Un método para producir vectores lentivirales que comprende:

i. cultivar una línea celular productora según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 29 10