TIMIDINA QUINASA.

La presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica un gen de timidina quinasa sustancialmente no susceptible de remodelación, y su uso en terapia. Antecedentes de la Invención Existe un interés considerable en el uso de genes suicidas metabólicos en terapia génica. En la bibliografía se describen numerosos genes suicidas, tales como, por ejemplo, los genes que codifican citosina-desaminasa, purinanucleósido-fosforilasa o una timidina quinasa. Entre estos genes, el gen que codifica la timidina quinasa del virus del herpes simplex tipo 1 (HSV-tk) es especialmente ventajoso desde un punto de vista terapéutico. El gen HSV-tk expresa una enzima que cuando se utiliza en combinación con el análogo de nucleósido ganciclovir, es capaz de eliminar específicamente las células en división. De particular importancia es la presencia de un efecto propagado de toxicidad (efecto "espectador") que está asociado con el uso de HSV-tk/ganciclovir. Este efecto se manifiesta en sí mismo en la destrucción no sólo de las células que han incorporado el gen de timidina quinasa (tk) sino también las células vecinas. El mecanismo de acción del sistema HSV-tk/ganciclovir puede reseñarse como sigue: las células de mamífero modificadas para expresar la enzima TK implementan el primer paso de fosforilación de ganciclovir para producir ganciclovir-monofosfato. Subsiguientemente, las quinasas celulares permiten que este ganciclovir-monofosfato se metabolice sucesivamente a difosfato y luego trifosfato. El ganciclovir-trifosfato así generado, produce luego efectos tóxicos al incorporarse en el DNA, e inhibe parcialmente la polimerasa alfa del DNA celular, causando con ello la detención de la síntesis de DNA y conduciendo por consiguiente a la muerte celular (Moolten, 1986; Mullen, 1994). El sistema HSV-tk/ganciclovir puede utilizarse en un gran número de aplicaciones terapéuticas y se han implementado numerosas pruebas clínicas en la última década. Métodos de utilización del gen HSV-tk en terapia génica se describen, por ejemplo, en los documentos WO 90/07936, US 5.837.510, US 5.861.290, WO 98/04290, WO 97/37542 y US 5.631.236. Una aplicación interesante del sistema HSV-tk/ganciclovir es en la prevención de la enfermedad de rechazo inverso (GvHD), una afección que puede interferir con el resultado del trasplante alogénico de médula ósea, el tratamiento de elección para muchas enfermedades malignas hematológicas. La GvHD ocurre cuando las células T en el injerto de células madre trasplantado comienzan a atacar el cuerpo del receptor. La eliminación de las células T del injerto puede prevenir la GvHD, pero favorece también la recurrencia de la enfermedad y el rechazo del injerto. Para contrarrestar estos efectos, los pacientes de trasplante alogénico de médula ósea pueden tratarse por introducción de linfocitos T del donante después de un cierto retardo subsiguiente al trasplante alogénico de médula ósea. La transferencia del gen HSV-tk a los linfocitos T del donante permite su erradicación después de la administración de ganciclovir en el caso de la aparición de GvHD. En una prueba, los pacientes recibieron un trasplante de médula ósea empobrecido en células T junto con dosis crecientes de linfocitos donantes transducidos con el gen HSV-tk (Tiberghien et al., 2001). Las células circulantes que expresaban HSV-tk pudieron detectarse durante más de un año después del injerto de todos los pacientes. Seis de los doce pacientes desarrollaron GvHD y recibieron ganciclovir, reduciendo sustancialmente el número de células circulantes modificadas (disminución media de 85% en número absoluto). Se han producido mutantes en el gen HSV-tk que aumentan su actividad biológica. Ejemplos de tales genes HSV-tk mutantes se describen, por ejemplo, en Kokoris et al (1999), WO 95/30007, US 5.877.010, WO 99/19466 y WO 95/14102. Sin embargo, un grave problema asociado con el sistema timidina quinasa/ganciclovir es la aparición de resistencia a ganciclovir en las células HSV-tk transducidas. Esto tiene una importancia particular, dado que la proporción relativa de células que son resistentes a ganciclovir puede aumentar rápidamente a lo largo del curso de tratamiento. Se encontró que la presencia de resistencia a ganciclovir en una línea de células T linfoblastoides humanas transducida con un vector retroviral que contiene el gen HSV-tk está asociada con una deleción de 227 pares de bases en el gen HSV-tk (Fillat et al., 2003). La misma deleción estaba presente también en células T humanas primarias transducidas con el vector y en 12 pacientes que recibieron células T transducidas del donante (Garin et al., 2001). WO 01/79502 describe que la causa de esta deleción se cree es debida a la presencia de secuencias de nucleótidos en el mRNA de HSV-tk que actúan como sitios de remodelación para causar la producción de una proporción de partículas de virus que llevan una forma aberrante del gen, llevando el resto el gen de longitud total. Un mutante del gen de timidina quinasa se describe en WO 01/79502 y en Chalmers 2001, Molecular Therapy 4:146-148, en la cual se han eliminado los sitios de remodelación, y que reduce la producción de la forma aberrante del gen de timidina quinasa. Sin embargo, este mutante está asociado todavía con una cantidad perjudicial de 2   remodelación génica. Constructos de fusión CD34-tk se describen en Rettig et al., 2003. Estos constructos de fusión contienen genes HSV-tk modificados. Sin embargo, no existe demostración alguna de que los genes modificados reduzcan la remodelación del mRNA de HSV-tk. Así pues, persiste la necesidad de un gen de timidina quinasa modificado que no sea susceptible de remodelación génica y que aborde los problemas asociados con la resistencia a ganciclovir. Sumario de la Invención La presente invención resuelve el problema arriba mencionado proporcionando un gen de HSV-tk que expresa una mayor proporción de mRNA que no ha sufrido remodelación que los genes HSV-tk descritos previamente. Los autores de la presente invención han identificado un sitio aceptor de remodelación 14 pares de bases aguas arriba del sitio aceptor identificado previamente. Se demuestra que los intentos previos para inhibir la remodelación por modificación de los sitios donantes y aceptores identificados previamente pueden dar como resultado la activación de este sitio aceptor y la remodelación génica subsiguiente. Sorprendentemente, los autores de esta invención demuestran que la modificación del gen HSV-tk en ciertos nucleótidos específicos proporciona un gen HSV-tk que es capaz de expresar mRNA sustancialmente exento de remodelación. En particular, se demuestra que la mutación de al menos uno de los nucleótidos en el sitio de remodelación del donante puede prevenir sustancialmente la remodelación. Exposición de la Invención Se describe un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una timidina quinasa en donde al menos uno de los nucleótidos que corresponden a nucleótidos de sitios donantes de remodelación ha sido reemplazado por otro nucleótido y en donde los nucleótidos de los sitios aceptores de remodelación no se han alterado. De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una timidina quinasa en donde al menos uno de los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos de los sitios de remodelación del donante en las posiciones 329 y 330 de la secuencia de tipo salvaje de la Figura 1 (Tk wt) se ha reemplazado por otro nucleótido y en donde los nucleótidos de los sitios aceptores de remodelación no se han alterado. En una realización, ambos nucleótidos correspondientes a los nucleótidos del sitio donante de remodelación en las posiciones 329 y 330 de la secuencia de tipo salvaje de la Figura 1 se han reemplazado por otro nucleótido. En una realización, el nucleótido de la posición 330 ha cambiado de T a C. De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una timidina quinasa en donde al menos uno de los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos de los sitios donantes de remodelación en las posiciones 329 y 330 de la secuencia de tipo salvaje de la Figura 1 (Tk wt) se ha reemplazado por otro nucleótido y en donde al menos uno de los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos de los sitios aceptores de remodelación en las posiciones 554 y 555 y al menos uno de los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos de los sitios aceptores de remodelación en las posiciones 662 y 663 de la secuencia de tipo salvaje de la Figura 1 no se ha alterado. Preferiblemente, ambos nucleótidos correspondientes a las posiciones 554 y 555 no se han alterado. Preferiblemente,... [Seguir leyendo]

1.- Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una timidina quinasa, caracterizado porque en el al menos uno de los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos de los sitios donantes de remodelación en las posiciones 329 y 330 de la secuencia de tipo salvaje de la Figura 1 (TK wt) se ha reemplazado por otro nucleótido y en donde los nucleótidos de los sitios aceptores de remodelación no se han alterado. 2.- Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque en el mismo ambos nucleótidos correspondiente a los nucleótidos de los sitios donantes de remodelación en las posiciones 329 y 330 de la secuencia de tipo salvaje de la Figura 1 se han reemplazado por otro nucleótido. 3.- Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque en el mismo el polinucleótido correspondiente a la posición 330 está cambiado de T a C. 4.- Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una timidina quinasa caracterizado porque en el mismo al menos uno de los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos de los sitios donantes de remodelación en las posiciones 329 y 330 de la secuencia de tipo salvaje de la Figura 1 (Tk wt) se ha reemplazado por otro nucleótido y los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos de los sitios aceptores de remodelación en las posiciones 554 y 555 y los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos de los sitios aceptores de remodelación en las posiciones 662 y 663 de la secuencia de tipo salvaje de la Figura 1 no se han alterado. 5.- Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque en el mismo ambos nucleótidos correspondientes a las posiciones 329 y 330 se han reemplazado por otro nucleótido. 6.- Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque en el mismo el nucleótido correspondiente a la posición 330 está cambiado de T a C. 7.- Un polinucleótido que comprende la secuencia TkMut2 de la Figura 1. 8.- Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una timidina quinasa caracterizado porque en el mismo al menos uno de los nucleótidos de los sitios donantes de remodelación correspondientes al o a los nucleótidos de las posiciones 329 y 330 de la secuencia de tipo salvaje de la Figura 1 (Tk wt) se ha reemplazado por otro nucleótido y en donde al menos uno de los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos de los sitios aceptores de remodelación en las posiciones 541 y 542 de la secuencia de tipo salvaje de la Figura 1 se ha reemplazado por otro nucleótido. 9.- Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque en el mismo ambos nucleótidos correspondientes a las posiciones 541 y 542 se han reemplazado por otro nucleótido. 10.- Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque en el mismo ambos nucleótidos correspondientes a las posiciones 329 y 330 se han reemplazado por otro nucleótido. 11.- Un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 caracterizado porque en el mismo el nucleótido correspondiente a la posición 330 está cambiado de T a C. 12.- Un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 caracterizado porque en el mismo el nucleótido correspondiente a la posición 541 está cambiado de A a T. 13.- Un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 caracterizado porque en el mismo el nucleótido correspondiente a la posición 542 está cambiado de G a C. 14.- Un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 caracterizado porque en el mismo al menos uno de los nucleótidos correspondiente a los nucleótidos de los sitios aceptores de remodelación en la posición 554 y 555 de la secuencia de tipo salvaje de la Figura 1 se ha reemplazado también por otro nucleótido de tal modo que no está presente sitio alguno de remodelación. 15.- Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado porque en el mismo el nucleótido correspondiente a la posición 555 esta cambiado de G a A. 16.- Un polinucleótido que comprende la secuencia TkMut23 de la Figura 1. 17.- Un polinucleótido que comprende la secuencia TkMut234 de la Figura 1.   18.- Un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 caracterizado porque en el mismo el nucleótido de reemplazamiento no altera la secuencia del polipéptido codificado por dicha secuencia de nucleótidos. 19.- Un vector que comprende un polinucleótido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores. 20.- Una célula hospedadora que comprende un polinucleótido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o un vector como se define en la reivindicación 19. 21.- Una composición farmacéutica que comprende un polinucleótido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, un vector como se define en la reivindicación 19, o una célula hospedadora como se define en la reivindicación 20 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 22.- Un kit que se caracteriza por comprender (i) un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18; o un vector como se define en la reivindicación 19, o una célula hospedadora como se define en la reivindicación 20, o una composición farmacéutica como se define en la reivindicación 21; y (ii) un agente sustancialmente no tóxico que es convertido por una timidina quinasa en un agente tóxico. 23.- Un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, un vector como se define en la reivindicación 19, una célula hospedadora como se define en la reivindicación 20 o una composición farmacéutica como se define en la reivindicación 21 para uso en medicina. 24.- Un polinucleótido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, un vector como se define en la reivindicación 19 o una célula hospedadora como se define en la reivindicación 20 para destruir células en un paciente. 25.- Un polinucleótido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, un vector como se define en la reivindicación 19 o una célula hospedadora como se define en la reivindicación 20 para tratamiento del cáncer. 26.- Un polinucleótido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, un vector como se define en la reivindicación 19 o una célula hospedadora como se define en la reivindicación 20 para prevenir la enfermedad de rechazo inverso. 27.- Productos que contienen un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, un vector como se define en la reivindicación 19, una célula hospedadora como se define en la reivindicación 20 o una composición farmacéutica como se define en la reivindicación 21, y un agente sustancialmente no tóxico para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de un paciente con células que precisan destrucción, en donde dicho agente sustancialmente no tóxico es convertido por una timidina quinasa en un agente tóxico. 28.- Un producto de acuerdo con la reivindicación 27 o un kit de acuerdo con la reivindicación 22 en donde el agente sustancialmente no tóxico es uno cualquiera de ganciclovir, aciclovir, trifluorotimidina, 1-[2-desoxi, 2-fluoro, ß-Darabinofuranosil]-5-yodouracilo, ara-A, ara 1,1-ß-D-arabinofuranosil-timina, 5-etil-2'-desoxiuridina, 5-yodo-5'-amino- 2,5'-didesoxiuridina, idoxuridina, AZT, AIV, didesoxicitidina, Ara C y bromovinil-desoxiuridina (BVDU). 26   Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el solicitante es para comodidad del lector únicamente. No forma parte del documento de la patente europea. Aun cuando se tuvo gran cuidado al reunir las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes (EPO) declina toda responsabilidad a este respecto. Los documentos de patente citados en la descripción Literatura no de patentes citada en la descripción 27   28   29     31 Figura 1   Secuencia de remodelación de consenso: Donante Intrón Aceptor 32 Figura 2   Iniciadores: Iniciadores: Iniciadores: secuenciación 401pb 1020 pb 33 Figura 3   Iniciadores HTK4+/H/TKA2- Iniciadores TK2S/TKAS 644 pb 1020 pb 34 Figura 4   sitio donante   Esquema de mutaciones introducidas en el vector SFCMM-3 Sitio aceptor Sitio donante 36 Figura 6   Iniciadores TKA1/TKB1 401pb 37 Figura 7   Iniciadores TKA1/TKB1 401 pb 38 Figura 8   Iniciadores TKA1/TKB1 401 pb 39 Figura 9   Iniciadores TKY1TKY2 Iniciadores TKZ1TKZ2 542 pb 1149 pb clon TK3 wt clon TK3 remodelado clon TK3 wt clon TK3 remodelado Figura 10   Iniciadores TKA1TKB1 401 pb 41 Figura 11   Iniciadores TKZ1TKZ2 1149 pb 42 Figura 12