Producción semiestable de vectores lentivíricos.

Sistema para la expresión estable de proteínas reguladoras y estructurales lentivíricas que consiste en:

i. Un vector híbrido que comprende un esqueleto baculovírico que contiene un casete de integración flanqueado por las ITR de AAV que incluyen dos casetes de expresión, en donde el primer casete de expresión codifica los genes de gag y pol lentivíricas y el segundo la rev lentivírica y un marcador de selección, y

ii. Un plásmido de expresión que contiene el marco abierto de lectura (ORF) de la rep de AAV bajo el control de un promotor.

Producción semiestable de vectores lentivíricos Campo de la invención La presente invención se refiere a la producción de vectores lentivíricos (VL) para genoterapia. Más en particular, la invención se refiere a líneas celulares semiestables para empaquetamiento de lentivirus y a procedimientos para 5 fabricar líneas celulares para empaquetamiento mediante el uso de un vector híbrido de baculovirus y dependovirus (AAV, por virus adenoasociado) para la integración estable de proteínas lentivíricas reguladoras y estructurales.

Antecedentes

Desde el primer ensayo clínico de fase I de VL contra el sida en 2001, se han sometido al escrutinio de las autoridades 38 ensayos de fase I-II y dos de fase II-III que explotan los VL basados en el VIH como vehículos de 10 introducción de genes; tres de ellos están todavía en revisión. El número de ensayos más grande comprende trastornos monogénicos, algunos de los cuales tienen una gran incidencia, tal como la talasemia ß mayor o anemia de Cooley (4 ensayos) . Le siguen el cáncer y las enfermedades infecciosas, principalmente por el VIH-1. Lo habitual es que el número de pacientes que participen en los ensayos de fase I/II sea pequeño, pero no el de la fase III. Así pues, se necesitan con urgencia líneas celulares estables para empaquetamiento para los VL de segunda (basados 15 en LTR) y de tercera (basados en SIN) generación para afrontar la demanda de producción a gran escala de VL para el gran número de ensayos de fase III que se espera que se realicen en el futuro. La producción de VL basados en protocolos transitorios es realmente poco práctico para la aplicación global desde un punto de vista de seguridad, coste y reproducibilidad.

Cada vez hay más pruebas que indican que los VL, los vectores integrativos víricos desarrollados más 20 recientemente para la genoterapia, se pueden aplicar de forma general para transducir las células diferenciadas a término o en el ciclo celular, ideales para sostener la expresión de transgenes a largo plazo y más seguros de lo que se temía inicialmente. La experiencia acumulada sobre los vectores -retrovíricos (RV) del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV) a lo largo de las dos últimas décadas guió el rápido progreso del sistema de introducción con VL, cuyo desarrollo se originó por la necesidad de superar la incapacidad del retrovirus para 25 transducir las células que no se dividen. En particular, la generación de vectores de transferencia autoinactivantes (SIN, por su nombre en inglés) hace que sea más factible1 la perspectiva de que los VL se usen ampliamente en los ensayos clínicos humanos dada la expansión y optimización de un procedimiento de fabricación muy eficaz. Sin embargo, a diferencia de los RV, que se pueden producir en varias líneas celulares para empaquetamiento comercialmente disponibles murinas y humanas, los VL se producen actualmente no sólo para investigaciones, sino 30 también cumpliendo las normas de correcta fabricación, casi exclusivamente mediante transfección transitoria. Esta tecnología es cara, difícil de estandarizar y escalar, y requiere numerosas pruebas de validación posteriores. Además, el riesgo de formación de lentivirus capaces de replicarse, que posiblemente surgen por recombinación entre las secuencias víricas de las construcciones en los vectores de transferencia y para empaquetamiento, es un acontecimiento infrecuente, pero es más probable durante la producción transitoria que durante la estable. 35

El desarrollo de una línea celular estable para empaquetamiento de VL que sea equivalente a la retrovírica resultó ser más lento y más difícil porque, a diferencia de los retrovirus , la expresión de las proteínas lentivíricas, tales como env, proteasa y algunas proteínas accesorias, es tóxica para las células humanas. Para solucionar este problema, los genes accesorios, presentes en las primeras versiones de las células para empaquetamiento, se retiraron posteriormente en las últimas generaciones. Líneas celulares para empaquetamiento de VL basados en el 40 VIS y en el VIH de primera generación se obtuvieron de las células adheridas Vero de mono o COS, HeLa y 293 de humano2-5, manipuladas genéticamente con genomas de lentivirus que llevan unas pocas modificaciones cruciales, tales como la retirada de la señal de empaquetamiento. De hecho, se mantuvieron la env gp120 y la mayoría de los genes accesorios. La titulación de los VL resultantes era muy baja2-5 y, lo más importante, la posible aplicación de estos vectores estaba restringida necesariamente a los linfocitos T CD4+ para las estrategias de genoterapia 45 antisida. Más tarde, la env gp120 se sustituyó por la glucoproteína procedente del virus de la estomatitis vesicular (G-VSV) y se retiraron todos los genes accesorios, ya que se comprobó que eran prescindibles para una producción eficiente de VL. Para impedir la toxicidad también descrita para la G-VSV, su expresión se indujo condicionalmente mediante una serie de sistemas diferentes, tales como Tet, ecdisona, Rev y la combinación de Tet y cumato6. De igual forma, para reducir el efecto tóxico de la proteasa vírica durante la selección del clon, se ha descrito la 50 expresión condicional del gen de gag-pol por Tet y la combinación de los fármacos doxiciclina y cumato6. En todos estos sistemas, los genes de gag-pol, de rev y de env se integraron mediante la transfección transitoria del ADN plasmídico y la posterior selección con el fármaco y la clonación celular.

Una de las cuestiones cruciales para la consolidación de una línea celular para empaquetamiento verdaderamente estable es la elección de los mejores vehículos víricos para la introducción de genes. La mayoría de los 55 investigadores integraron los genes de gag-pol, de rev y de env mediante la transfección transitoria de ADN plasmídico, y la posterior selección con el fármaco y clonación celular2-9 Esta tecnología se sabe que acabará viéndose afectada con el tiempo por el silenciamiento génico y la pérdida génica10, que pueden poner en peligro la estabilidad a largo plazo del clon para empaquetamiento.

Se han descrito vehículos alternativos para la introducción de genes, en particular en STAR11 y en las líneas celulares para empaquetamiento GPRG-TL-2012 desarrolladas más recientemente, donde los genes de gag, pol y rev se integraron en las células HEK293T mediante vectores lanzadera de MLV. Se integraron de forma estable en STAR dos copias del gen de gag-pol recodificado, mientras que no se dispone de información para GPRG-TL-2012. A diferencia de STAR, donde se transfectó el gen de env, en GPRG-TL-20 se introdujeron todos los genes víricos 5 restantes mediante SIN-MLV.

Existen varios sistemas que permiten la integración estable del genoma foráneo en las células hospedadoras. En Palombo et al., 199813, se describe un vector híbrido baculovirus-AAV para la integración específica en las células hospedadoras. Tal vector es muy eficaz si incluye el gen de rep en el mismo vector híbrido baculovirus-AVV. No se menciona en esta referencia la construcción de la presente invención y mucho menos se sugiere el uso de esta 10 clase de sistema para la producción de VL.

A lo largo de las últimas casi dos décadas, se han ha intentado varias veces generar líneas celulares estables para empaquetamiento de VL. A pesar de la diferente tecnología descrita, hoy en día ninguna de estas líneas celulares para empaquetamiento se emplea todavía en los ensayos clínicos ni se ha llegado a comercializar. Por lo tanto, se necesitan nuevos sistemas para la producción a gran escala de VL que sean eficaces en términos de capacidad de 15 producción y que sean seguros, rentables y reproducibles.

Compendio de la invención La presente invención se refiere al campo de la producción de VL. Están en marcha varios ensayos clínicos de genoterapia que emplean los VL como vehículos para la introducción de genes. En todos estos ensayos, la producción de VL se basa todavía en protocolos transitorios. 20

La presente invención da a conocer una nueva estrategia para generar una línea celular para empaquetamiento basada en el VIH-1. Tal estrategia se basa en el uso de un vector híbrido que comprende un esqueleto baculovírico que contiene un casete de integración flanqueado por repeticiones terminales invertidas (ITR, por su nombre en inglés) de AAV, el denominado sistema híbrido baculo-AAV, en combinación con un plásmido que codifica una proteína rep. Este sistema permite obtener una integración estable de gag/pol y rev, proteínas del VIH-1 reguladoras 25 y estructurales. El sistema de la presente invención incluye a) un vector híbrido baculo-AAV caracterizado por contener dos casetes de expresión, uno que codifica los... [Seguir leyendo]

1. Sistema para la expresión estable de proteínas reguladoras y estructurales lentivíricas que consiste en:

i. Un vector híbrido que comprende un esqueleto baculovírico que contiene un casete de integración flanqueado por las ITR de AAV que incluyen dos casetes de expresión, en donde el primer casete de expresión codifica los genes de gag y pol lentivíricas y el segundo la rev lentivírica y un marcador de selección, y ii. Un plásmido de expresión que contiene el marco abierto de lectura (ORF) de la rep de AAV bajo el control de un 5 promotor.

2. Sistema de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los dos casetes de expresión del vector híbrido están orientados cola con cola y cada uno está impulsado por un promotor constitutivo y lleva un poli A.

3. Sistema de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el promotor se selecciona de CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1, SFFV y RSV. 10

4. Sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el promotor es un promotor CMV IE.

5. Sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el marcador de selección se selecciona de gen de resistencia a higromicina, a kanamicina, a neomicina, a zeomicina.

6. Sistema de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el marcador de selección es el gen de resistencia a la higromicina. 15

7. Sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el marcador de selección está clonado detrás de un sitio interno de entrada del ribosoma (IRES, por su nombre en inglés) .

8. Sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína rep es rep78.

9. Línea celular semiestable para empaquetamiento de lentivirus que consiste en células que expresan de forma estable gag, pol y rev lentivíricas, caracterizada por contener tales células integrada de forma estable en su genoma 20 al menos una copia de un casete de integración flanqueado por las ITR de AAV que incluyen dos casetes de expresión, en donde el primer casete de expresión codifica los genes de gag y pol lentivíricas y el segundo la rev lentivírica y un marcador de selección.

10. Línea celular semiestable para empaquetamiento de lentivirus de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la célula es una línea celular de humano seleccionada de HEK293, HEK293-T, HEK293-SF, TE671, HT1080 o HeLa. 25

11. Línea celular semiestable para empaquetamiento de lentivirus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, en donde los dos casetes de expresión están orientados cola con cola y cada uno está impulsado por un promotor constitutivo y lleva un poli A.

12. Línea celular semiestable para empaquetamiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 o 11, en donde el promotor se selecciona de CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1, SFFV y RSV. 30

13. Línea celular semiestable para empaquetamiento de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el promotor es un promotor CMV IE.

14. Línea celular semiestable para empaquetamiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en donde el marcador de selección se selecciona de gen de resistencia a higromicina, a kanamicina, a neomicina, a zeomicina. 35

15. Línea celular semiestable para empaquetamiento de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el marcador de selección es el gen de resistencia a la higromicina.

16. Línea celular semiestable para empaquetamiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, en donde el marcador de selección está clonado detrás de un sitio interno de entrada del ribosoma (IRES) .

17. Procedimiento para producir vectores lentivíricos que comprende: 40

i. Cultivar una línea celular semiestable para empaquetamiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16

ii. Insertar en la línea celular semiestable para empaquetamiento un gen de env mediante un vector de expresión

iii. Insertar en la línea celular semiestable para empaquetamiento un vector de transferencia.

18. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el gen de env se selecciona de env G-VSV, env 4070 de MLV, env RD114, proteína quimérica de envoltura RD114-TR, proteína quimérica de envoltura RD114-pro, env GP64 de baculovirus o env de GaLV, o derivados de las mismas.

19. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17 o 18, en donde el gen de env es el gen que codifica la proteína quimérica de envoltura RD114-TR. 5