Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica Vif caracterizada porque en la misma cada uno de los aminoácidos correspondientes a las posiciones 127,

128, 130, 131, 132 y 142 de la secuencia en la Figura 1A son N, V, R, L, S e I respectivamente y en donde la totalidad de los aminoácidos correspondientes a las posiciones 22, 29, 41, 66, 80, 109, 185 y 186 no son I, I, K, V, N, R, R y N respectivamente

Mutantes de Vif del HIV.

Campo de la Invención La presente invención se refiere a un vector lentiviral y su uso en un método de impartir resistividad a la infección por HIV, con inclusión de superinfección de HIV.

Antecedentes de la Invención El SIDA es una de las causas principales de muerte en el mundo en desarrollo, alcanzando su propagación proporciones de pandemia. Sin embargo, la erradicación de HIV-1 está lejos de alcanzarse. En la actualidad, la terapia con anti-retrovirales altamente activos (HAART) es el único tratamiento eficaz para reducir la progresión y propagación del SIDA, aunque su uso a largo plazo está asociado con inconvenientes y limitaciones tales como adherencia a un régimen de dosificación complejo, toxicidad con efectos secundarios y coste elevado (Richman et al., 2001) . La gran variabilidad genética y antigénica intra-e inter-subtipos del HIV-1, resultante de la alta tasa de mutación de su genoma, junto con cumplimiento inadecuado, es responsable de la resistencia a los fármacos HAART, así como del fracaso repetido en el desarrollo de una vacuna preventiva basada en clados múltiples (Ho et al., 2002) . Sobre esta base, es imprescindible el desarrollo de estrategias terapéuticas alternativas y/o adicionales contra el SIDA.

Muchos años de investigación pre-clínica han demostrado que el ciclo vital del HIV-1 puede verse interferido a muchos niveles, y han demostrado al menos el concepto de la terapia génica anti-HIV (Buchschacher et al., 2001) . Las células madre hematopoyéticas (HSCs) , los precursores de células T o los linfocitos T pueden modificarse genéticamente con, por ejemplo, genes codificantes de ribozimas, cebos, moléculas de RNA de interferencia antisentido y pequeño (siRNA) dirigidas contra genes virales y celulares (Buchschacher et al., 2001; Jacque et al., 2002; Novina et al., 2002; Lee et al., 2002; Coburn et al., 2002; Qin et al., 2003) , o proteínas tales como intraquinas, toxinas y anticuerpos monocatenarios. Sin embargo, las pruebas clínicas tempranas con linfocitos T transducidos con vectores retrovirales que expresan mutantes transdominantes de proteínas virales o ribozimas anti-HIV-1 han sido decepcionantes (Woffendin et al., 1996; Ranga et al., 1998; Wong-Staal et al., 1998) debido principalmente a la baja eficiencia de transferencia de genes, injerto insuficiente y corta persistencia in vivo de las células T modificadas genéticamente. La mayor parte de los estudios preclínicos y clínicos realizados hasta ahora se han basado en el uso de vectores retrovirales derivados del virus de la leucemia murina de Moloney (MLV) para transducir células HSCs o células T. Sin embargo, los vectores derivados de MLV han mostrado limitaciones importantes para aplicaciones clínicas, tales como escasa eficiencia en la transducción de las células HSCs y T que no encuentran en división, expresión insuficiente de productos anti-HIV potencialmente terapéuticos y propensión a inducir neoplasia por activación insercional de oncogenes (Baum et al., 2003) .

Entre las posibles dianas de la terapia génica anti-HIV se encuentra el producto del gen del factor de infectividad viral (vif) . Vif es uno de los cuatro genes accesorios de HIV-1, expresado en una fase tardía durante la replicación del virus de una manera dependiente de Rev (Cullen et al., 1998; Frankel et al., 1998) . La proteína Vif se requiere para infectividad viral alta en las denominadas células 'no permisivas', que incluyen las dianas naturales de HIV-1 (células T y macrófagos) y algunas líneas de células T, por ejemplo, CEM, H9, y HUT 78 (Fisher et al., 1987; Fouchier et al., 1996; Gabuzda et al., 1992; Sheehy et al., 2002; Simon et al., 1996; von Schedler et al., 1993) . Este requerimiento depende de la capacidad de Vif para contrarrestar la acción de la recién identificada proteína CEM15/APOBEC-3G (Sheehy et al., 2002) que confiere inmunidad innata a HIV-1. Así, la discapacitación, o la interferencia con la función de Vif podrían representar un enfoque terapéutico anti-HIV-1 alternativo.

F12-vif es un mutante natural de vif, que lleva 15 sustituciones de aminoácidos singulares, descubierto originalmente en la variante F12 no productora de HIV-1 (Federico et al., 1989; Carlini et al., 1992; Carlini et al., 1996) . El HIV F12 no productor induce un bloqueo en la replicación de HIV superinfectante y F12-Vif puede jugar un papel en la infectividad reducida de este productor. Sin embargo, existe necesidad de proporcionar mutantes vif adicionales con actividad anti-HIV, y proporcionar sistemas de suministro eficaces para estos mutantes. La presente invención trata de resolver estos problemas.

Sumario de la Invención Se han desarrollado nuevos mutantes de vif que son altamente eficaces en la inhibición de la replicación de HIV-1 in vitro en líneas de células T infectadas con HIV-1. En particular, se ha encontrado que una proteína Vif que comprende reemplazamiento de aminoácidos en los aminoácidos correspondientes a las posiciones 12, 28, 130, 131, 132 y 142 de la secuencia de tipo salvaje es suficiente para ejercer efecto antiviral contra HIV. Además, se demuestra que una región de 45 aminoácidos de F12-Vif (Chim3) , que lleva sólo 6 sustituciones singulares de aminoácidos, incrustadas en un contexto WT-Vif, protege los linfocitos T humanos contra la infección de HIV-1. Adicionalmente, se muestra que, en contraste con F12-Vif, Chim3 no puede restablecer la replicación de viriones deficientes de Vif (lvif HIV-1) en células no permisivas, haciendo el uso de este mutante mucho más seguro en situaciones en las cuales el mismo encuentra cuasiespecies lvif HIV-1 alojadas de modo silencioso en un paciente.

Una ventaja asociada con una realización de la presente invención es que el transgén mutante Vif se encuentra bajo el control de la transcripción de una LTR de HIV-1 de tipo salvaje dependiente de Tat, que está activada sólo en las células infectadas por HIV-1, evitando así la expresión innecesaria de un antígeno extraño en HSCs transducidas y su progenie, es decir, que la expresión de HIV-1 se halla bajo control inducible por HIV-1.

Enunciados de la Invención De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica Vif en donde cada uno de los aminoácidos correspondientes a las posiciones 127, 128, 130, 131, 132 y 142 de la secuencia en la Figura 1A son N, V, R, L, S e I respectivamente y en donde la totalidad de los aminoácidos correspondientes a las posiciones 22, 29, 41, 66, 80, 109, 185 y 186 no son I, I, K, V, N, R, R y N, respectivamente.

Preferiblemente, la totalidad de los aminoácidos correspondientes a las posiciones 22, 29, 41, 48, 66, 80, 109, 185 y 186 no son I, I, K, N, V, N, R, R y N, respectivamente.

En una realización, el aminoácido correspondiente a la posición 48 es N.

Preferiblemente, los aminoácidos correspondientes a las posiciones 22, 29, 41, 48, 66, 80, 109, 185 y 186 son los presentes en una Vif existente naturalmente, tales como, pero sin carácter limitante, HXB2 acc.#K03455, BRU acc.#K02013, SF2 acc.#K02007, PV22 acc.#K02083, MN acc.#M17449 y NL4-3 acc.#M19921 (véanse las Figuras 1A, 1B y 1C) . Aminoácidos adecuados para estas posiciones son, pero sin carácter limitante, 22 (K) , 29 (M) , 41 (R) , 48 (N o H) , 66 (I) , 80 (H) , 109 (L) , 185 (G) , 186 (S) . A este respecto, la secuencia de vif existente naturalmente no es F12-vif.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Vif quimérica que comprende los aminoácidos 126 a 170 de la secuencia F12-vif en la Figura 2 incrustada en una secuencia Vif existente naturalmente, tal como, pero sin carácter limitante, HXB2 acc.#K03455, BRU acc.# K02013, SF2 acc.# K02007, PV22 acc.# K02083, MN acc.#M17449 y NL4-3 acc. # M19921 (véanse las Figuras 1A, 1B, 1C y 2) . A este respecto, la secuencia de Vif existente naturalmente no es F12-Vif.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento del polipéptido Vif como se define arriba en donde el fragmento comprende al menos los aminoácidos correspondientes a 126 hasta 170 de la secuencia de la Figura 2.

Preferiblemente, el fragmento comprende al menos los aminoácidos 126 a 170 de la secuencia de la Figura 2.

En una realización, el fragmento consiste en los aminoácidos 126 a 170 de la secuencia de la Figura... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica Vif caracterizada porque en la misma cada uno de los aminoácidos correspondientes a las posiciones 127, 128, 130, 131, 132 y 142 de la secuencia en la Figura 1A son N, V, R, L, S e I respectivamente y en donde la totalidad de los aminoácidos correspondientes a las posiciones 22, 29, 41, 66, 80, 109, 185 y 186 no son I, I, K, V, N, R, R y N respectivamente.

2. Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica Vif de acuerdo con la reivindicación 1 que se caracteriza porque en el mismo la totalidad de los aminoácidos correspondientes a las posiciones 22, 29, 41, 48, 66, 80, 109, 185 y 186 no son I, I, K, N, V, N, R, R y N respectivamente.

3. Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica Vif de acuerdo con la reivindicación 1 que se caracteriza porque en el mismo el aminoácido correspondiente a la posición 48 es N.

4. Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica Vif de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que se caracteriza porque en el mismo los aminoácidos correspondientes a las posiciones 22, 29, 41, 48, 66, 80, 109, 185 y 186 son los presentes en un Vif existente naturalmente, y en donde dichos aminoácidos no son I, I, K, V, N, R, R, y N respectivamente.

5. Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica Vif de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que se caracteriza porque en el mismo el aminoácido correspondiente a la posición 22 es K, 29 es M, 41 es R, 48 es N o H, 66 es I, 80 es H, 109 es L, 185 es G y 186 es S.

6. Un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico Vif que comprende los aminoácidos 126 a 170 de la secuencia F12-Vif en la Figura 2 incrustado en una secuencia Vif existente naturalmente, que se caracteriza porque en el mismo la secuencia Vif existente naturalmente no es F12-Vif.

7. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 que se caracteriza por comprender una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 5A.

8. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza por comprender una secuencia de nucleótidos que se muestra en la Figura 15.

9. Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento del Vif como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que se caracteriza porque en el mismo dicho fragmento comprende al menos los aminoácidos correspondientes a 126 a 170 de la secuencia de la Figura 2.

10. Un polipéptido de Vif codificado por el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un fragmento de Vif codificado por el polinucleótido de la reivindicación 9.

11. Un polipéptido de Vif que se caracteriza por comprender la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 5A.

12. Un vector que se caracteriza por comprender un polinucleótido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

13. Un vector de acuerdo con la reivindicación 12 que se caracteriza porque en el mismo el vector es un vector retroviral o lentiviral.

14. Un vector de acuerdo con la reivindicación 13 que se caracteriza porque en el mismo el vector lentiviral puede derivarse de HIV.

15. Un vector de acuerdo con la reivindicación 13 ó 14 que se caracteriza porque en el mismo dicho polinucleótido está enlazado operativamente a una LTR viral.

16. Un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 que se caracteriza porque en el mismo la expresión de dicho polinucleótido es dependiente de tat.

17. Un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 que carece del gen tat.

18. Un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17 que se caracteriza porque en el mismo la expresión de dicho polipéptido se halla bajo control inducible de HIV-1.

19. Un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18 que carece de uno cualquiera o más, o la totalidad, de los genes gag, pol y env.

20. Un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19, que se caracteriza por comprender adicionalmente una secuencia de polinucleótidos que codifica un gen marcador seleccionable.

Figura 1A. Secuencia de Consenso WT-Vif

Figura 2. F12-Vif

Figura 4A. Chim2

Figura 4B. Chim2

Figura 6. Representación esquemática de los vectores lentivirales P.N, WT-VifP.N, F12-VifP.N, Chim1P.N, Chim2P.N, y Chim3P.N en sus formas provirales.

FIGURA 15 FIGURA 16 FIGURA 17

FIGURA 18

Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es para comodidad del lector únicamente. No forma parte del documento de la patente europea. Aun cuando se tuvo gran cuidado al reunir las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes (EPO) declina toda responsabilidad a este respecto.

Literatura no de patentes citada en la descripción