Inmunoconjugados para el tratamiento de tumores.

Una composición farmacéutica que comprende un conjugado de una citocina y al menos un resto de seleccióncomo objetivo de un tumor (TTM) que contiene el motivo NGR o el motivo RGD y un vehículo,

diluyente o excipientefarmacéuticamente aceptable, para el uso en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer, en la que el conjugado estápresente en una cantidad para proporcionar una dosis en el intervalo de 0,5 a 500 ng/kg, y en la que la citocina esTNF o IFNγ.

Inmunoconjugados para el tratamiento de tumores Campo de la invención La presente invención se refiere a una composición farmacéutica y a los usos de la misma.

Antecedentes de la invención La actividad antitumoral de ciertas citocinas es muy conocida y está bien descrita. Ciertas citocinas ya se han usado terapéuticamente en seres humanos. Por ejemplo, las citocinas tales como IL-2 e IFN-γ han mostrado una actividad antitumoral positiva en pacientes con diferentes tipos de tumores, tales como carcinoma metastásico de riñón, tricoleucemia, sarcoma de Kaposi, melanoma, mieloma múltiple, y similares. Otras citocinas similares a IFNβ, el Factor de Necrosis Tumoral (TNF) α, TNFβ, IL-1, 4, 6, 12, 15 y los Factores Estimuladores de Colonias (CFSs) han mostrado cierta actividad antitumoral en ciertos tipos de tumores.

En general, el uso terapéutico de las citocinas está claramente limitado por su toxicidad sistémica. TNF, por ejemplo, se descubrió en un principio por su capacidad de inducir la necrosis hemorrágica de ciertos tumores, y por su efecto citotóxico in vitro sobre diferentes líneas tumorales, pero posteriormente se demostró que tenía una actividad proinflamatoria intensa que, en caso de condiciones de sobreproducción, puede afectar peligrosamente al cuerpo humano.

Debido a que la toxicidad sistémica es un problema fundamental con el uso de cantidades farmacológicamente activas de citocinas en seres humanos, actualmente se están estudiando nuevos derivados y estrategias terapéuticas, dirigidas a reducir los efectos tóxicos de esta clase de efectores biológicos a la vez que se mantiene su eficacia terapéutica.

Ciertas aproximaciones nuevas se dirigen a:

a) el desarrollo de proteínas de fusión que pueden transportar TNF al tumor e incrementar la concentración local. Por ejemplo, se han producido proteínas de fusión que consisten en TNF y anticuerpos específicos de tumores;

b) el desarrollo de mutantes de TNF que mantienen la actividad antitumoral y tienen una toxicidad sistémica reducida. Por lo tanto, ya se han preparado mutantes capaces de reconocer de manera selectiva solamente un receptor;

c) el uso de anticuerpos anti-TNF capaces de reducir ciertos efectos tóxicos de TNF sin comprometer su actividad antitumoral. Tales anticuerpos ya se han descrito en la bibliografía;

d) el uso de derivados de TNF con una semivida mayor (por ejemplo, TNF conjugado con polietilen glicol) .

Se ha informado recientemente de la preparación de derivados de TNF capaces de seleccionar como objetivo las localizaciones tumorales. Por ejemplo, se ha descrito una proteína de fusión obtenida fusionando el gen de la cadena pesada de un mAb anti-receptor de transferrina y el gen de TNF, o una proteína de fusión de TNF con la región "bisagra" de un anticuerpo monoclonal hacia el antígeno TAG72 asociado a tumores, o una proteína de fusión Fv-TNF.

El documento EP 251 494 describe un sistema para administrar un agente diagnóstico o terapéutico, que comprende: un anticuerpo conjugado con avidina o estreptavidina, un agente capaz de complejar el anticuerpo conjugado y un compuesto que consiste en el agente diagnóstico o terapéutico conjugado con biotina, que se administran de manera secuencial y adecuadamente retrasada, para permitir la localización del agente terapéutico o diagnóstico por medio de la interacción biotina-estreptavidina en la célula objetivo reconocida por el anticuerpo. Los agentes terapéuticos o diagnósticos descritos comprenden quelatos metálicos, en particular quelatos de radionúclidos y agentes antitumorales de peso molecular bajo tales como cis-platino, doxorrubicina, etc.

El documento EP 496 074 describe un método que proporciona la administración secuencial de un anticuerpo biotinilado, avidina o estreptavidina y un agente diagnóstico o terapéutico biotinilado. Aunque se mencionan de manera genérica los agentes citotóxicos similares a ricina, se describe principalmente la aplicación relativa a los compuestos radiomarcados.

El documento WO 95/15979 describe un método para localizar agentes sumamente tóxicos en objetivos celulares, basado en la administración de un primer conjugado que comprende la molécula específica del objetivo conjugada con un ligando o un anti-ligando, seguido de la administración de un segundo conjugado que consiste en el agente tóxico unido a un anti-ligando o al ligando.

El documento WO 99/13329 describe un método para dirigir una molécula hacia vasos angiogénicos tumorales, basado en la conjugación de dicha molécula con ligandos de receptores NGR. Se han propuesto varias moléculas

como posibles candidatos, pero solamente se describe de manera específica la doxorrubicina. No se describe el uso de ligandos de receptores NGR como vehículos de citocinas para inducir respuestas inmunitarias.

En el documento WO01/61017 el presente inventor describe cómo descubrió sorprendentemente que el índice terapéutico de ciertas citocinas se puede mejorar notablemente y que sus propiedades inmunoterapéuticas se pueden potenciar mediante el acoplamiento con un ligando del receptor aminopeptidasa-N (CD13) . CD13 es una glicoproteína transmembrana de 150 kDa que está muy conservada en diversas especies. Se expresa en las células normales y también en las líneas tumorales mieloides, en el endotelio angiogénico y en ciertos epitelios. El receptor CD13 se identifica normalmente como el receptor "NGR", ya que sus ligandos peptídicos comparten el motivo de aminoácidos "NGR".

No obstante, sigue existiendo la necesidad de composiciones farmacéuticas y métodos adicionales y mejorados para el tratamiento y el diagnóstico del cáncer.

Sumario de la invención La administración y penetración de los fármacos en las células neoplásicas es crítica para la eficacia de la quimioterapia de tumores. Se ha descubierto que, sorprendentemente, la administración con selección del objetivo de dosis de picogramos de citocinas aumenta la penetración de los fármacos antineoplásicos. Con más detalle, se ha descubierto que la administración de dosis muy bajas de citocinas en tumores y en el medio asociado al tumor, que incluye la vasculatura tumoral, representa una aproximación nueva para evitar mecanismos de retroinhibición y para conservar su capacidad de alterar las barreras de penetración de fármacos. La presente invención representa así una estrategia nueva y sorprendente para incrementar el índice terapéutico de los fármacos antineoplásicos. En una realización preferida, se ha descubierto mediante el uso de la selección del objetivo vascular llevada a cabo acoplando TNF con CNGRC, un péptido que selecciona como objetivo la neovasculatura tumoral, que este tratamiento aumentó 8-10 veces la eficacia terapéutica de doxorrubicina, sin indicios de toxicidad incrementada. De forma similar, la selección del objetivo vascular aumentó la eficacia de melfalano, un fármaco antineoplásico diferente. Se observó sinergia con la quimioterapia con 3-5 ng/kg de TNF (i.p.) con selección del objetivo, 106 veces menor que la DL50 y 105 veces menor que la dosis necesaria para TNF sin selección del objetivo. Además, se ha descubierto también que la administración con selección del objetivo de dosis bajas de TNF en los vasos tumorales no induce la liberación de receptores de TNF solubles en la circulación. También se ha descubierto que RGD-TNF e IFNγ-NGR son activos en el intervalo de picogramos. También se ha demostrado que NGR-TNF incrementa el efecto del cisplatino. Estos resultados indican que la administración de cantidades mínimas de citocinas en los vasos tumorales representa una aproximación nueva para evitar los mecanismos de retroinhibición y para conservar su capacidad de alterar las barreras de penetración de fármacos. La selección del objetivo vascular de esta manera representa una estrategia nueva para incrementar el índice terapéutico de los fármacos antineoplásicos.

Declaraciones de la invención Se describe una composición farmacéutica que comprende un conjugado de una citocina y un resto de selección como objetivo de un tumor (TTM) y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, en el que la citocina está presente en una cantidad que no induce un mecanismo de retroinhibición. Así, la citocina está presente en una cantidad que no induce la escisión del receptor soluble de citocina.

Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer que comprende un conjugado de una citocina y al menos un resto de selección como objetivo de un tumor (TTM) que contiene el motivo NGR o el motivo RGD... [Seguir leyendo]

1. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado de una citocina y al menos un resto de selección como objetivo de un tumor (TTM) que contiene el motivo NGR o el motivo RGD y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, para el uso en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer, en la que el conjugado está presente en una cantidad para proporcionar una dosis en el intervalo de 0, 5 a 500 ng/kg, y en la que la citocina es TNF o IFNγ.

2. Una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer según la reivindicación 1, en la que el conjugado está presente en una cantidad para proporcionar una dosis en el intervalo de 1 a 50 ng/kg.

3. Una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer según la reivindicación 2, en la que el conjugado está presente en una cantidad para proporcionar una dosis en el intervalo de 5 a 15 ng/kg.

4. Una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer según la reivindicación 1, en la que el conjugado está presente en una cantidad de forma que el conjugado, o un metabolito del mismo, se proporciona al plasma sanguíneo de un paciente a tratar en una cantidad no mayor de alrededor de 35.000 ng/día para un paciente de 70 kg.

5. Una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer según cualquier reivindicación precedente, en la que la citocina es TNF-α o TNF-β.

6. Una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer según cualquier reivindicación precedente, en la que el TTM es un resto de selección como objetivo de la vasculatura tumoral (TVTM) .

7. Una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer según la reivindicación 6, en la que la TVTM es una molécula de unión de un receptor, marcador u otro componente extracelular de la vasculatura tumoral.

8. Una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el TTM es una molécula de unión de un receptor tumoral, marcador u otro componente extracelular.

9. Una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer según cualquier reivindicación precedente, en la que el TTM contiene el motivo NGR.

10. Una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer según la reivindicación 9, en la que el TTM es CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, cicloCVLNGRMEC, CNGRC lineal o cíclico.

11. Una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer según cualquier reivindicación precedente, en la que el TTM selecciona como objetivo una aminopeptidasa N (CD13) , integrina αvβ3

o integrina αvβ5.

12. Una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer según cualquier reivindicación precedente, en la que la citocina está unida a dicho TTM por medio de un espaciador.

13. Una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer según la reivindicación 12, en la que dicho espaciador es un único aminoácido, una secuencia de aminoácidos o un residuo orgánico.

14. Una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer según la reivindicación 12, en la que la citocina es TNF y el TTM es CNGRC, y en la que el TNF está unido al CNGRC por medio del espaciador G (glicina) .

15. Una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer según cualquier reivindicación precedente, en la que el conjugado está en forma de una proteína de fusión.

16. Una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que el conjugado está en forma de un ácido nucleico que codifica dicha citocina y TTM.

17. Una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer según cualquier reivindicación precedente, en la que la composición comprende además otro agente antitumoral o un compuesto de formación de imágenes para el diagnóstico de tumores.

18. Una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer según la reivindicación 17, en la que el agente antitumoral adicional es doxorrubicina, melfalano o cisplatino.

Volumen tumoral

Peso de los en el día 16 (mm3)

animales (g)

FIGURA 1

Volumen tumoralen el día 13 (mm3)

Dosis (ng)

Dosis (ng)

Dosis (ng)

Tiempo (día)

FIGURA 2

Dosis (ng)

FIGURA 3

Pérdida de peso de los animales

Volumen tumoral (mm3) Volumen tumoral (mm3)

desde el día 4 hasta el día 10 (g)

Melfalano solo NGR-mTNF o mTNF solo Melfalano (μg) Nada Melfalano (90 μg) + NGR-mTNF Melfalano (90 μg) + mTNF

Tiempo (día)

Melfalano (90 μg) + NGR-mTNF Melfalano (90 μg) + mTNF

FIGURA 4

Volumen tumoral

Pérdida de peso de los animales

Animales con un diámetroen el día 14 (mm3)

desde el día 5 hasta el día 8 (g)

tumoral <1 cm (%)

Doxorrubicina (μg)

NGR-mTNF Doxorrubicina (ng) (μg)

Tiempo (día)

FIGURA 5

Tiempo (día)

Cuentas Cuentas

FIGURA 6

Doxorrubicina (μg/ml)

Nada Doxorrubicina NGR-mTNF + doxorrubicina Nada Doxorrubicina

NGR-mTNF + doxorrubicina Fluorescencia Fluorescencia media Fluorescencia media

Fluorescencia media Doxorrubicina (μg/ml)

Células positivas (%) Células positivas (%)

FIGURA 7

Vasos normales Vasos tumorales Dosis baja (0, 01-0, 1 ng)

Flujo sanguíneo Dosis moderada (10 ng)

Dosis elevada (> 1000 ng)

FIGURA 8

Pérdida de peso de los animales (g) Volumen tumoral (mm3)

NGR-TNF Melfalano (ng) (μg)

RGD-TNF Melfalano (ng) (μg)

Tiempo (día) Días tras el tratamiento NGR-TNFRGD-TNF (ng) (ng)

MelfalanoMelfalano (μg) (μg)

FIGURA 9

FIGURA 10

Tratamiento (un Tiempo (día)