La presente invención se refiere a un método analítico para la detección y cuantificación de clopidogrel,

ácido salicílico y SR26334 en plasma mediante cromatografía líquida en tándem con espectrometría de masas (LC-MS/MS), y su aplicación en medicina, más concretamente en la monitorización de un tratamiento con clopidogrel y ácido acetilsalicílico.

Método de monitorización de clopidogrel y ácido acetilsalicílico.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método analítico para la detección y cuantificación de clopidogrel, ácido salicílico y SR26334 en plasma, y su aplicación en medicina, más concretamente en la monitorización de un tratamiento con clopidogrel y ácido acetilsalicílico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El clopidogrel y el ácido acetilsalicílico (AAS) son fármacos antiplaquetarios ampliamente utilizados, tanto solos como en combinación, para el tratamiento y/o la prevención de diferentes enfermedades cardiovasculares. Entre estas enfermedades se encuentran la arteriosclerosis y las enfermedades vasculares periféricas (Anand, S. et al., The New England Journal of Medicine, 2007, 357 (3) :217-227) , la trombosis (Sofi F et al., The Pharmacogenomics Journal, 2010, doi:10.1038/tpj.2010.21) , la hemorragia (Wallentin, L. et al., The Lancet, 2010, 376 (9749) :1320-1328) , las enfermedades coronarias (Azam, S.M. and Jozic, J., Translational Research, 2009, 154 (6) :309-313; Gurbel, P.A. et al., Circulation, 2009, 120 (25) :2577-2585 y otros; Wiviott, S. D. et al., The New England Journal of Medicine, 2007, 357 (20) :2001-2015) , el infarto de miocardio (Mega, J.L. et al., The Lancet, 2010, 376 (9749) :1312-1319) y los accidentes cerebrovasculares (Simon, T. et al., The New England Journal of Medicine, 2009, 360 (4) :363-375) .

El incumplimiento de los tratamientos por parte de los pacientes ha sido reconocido como una de las principales causas de la falta de respuesta a estos medicamentos (van der Wal et al, Eur J Heart Fail, 2005, 7:5-17; Cline et al, Eur J Heart Fail, 1999, 1 (2) :145-149) , por lo que resulta conveniente disponer de medios que permitan realizar el seguimiento de los tratamientos y detectar su incumplimiento.

El clopidogrel es un profármaco que requiere biotransformación hepática al metabolito activo del clopidogrel (MAC) , el cual actúa inhibiendo el receptor adenosina difosfato P2Y12 (Savi, P. et al, Journal of Thrombosis and Haemostasis, 1994; 72:313-317) . En la bibliografía se han divulgado dos métodos de análisis para la determinación del MAC (Delavenne, X. et al., Journal of Separation Science, 2010; 33:1968-1972; Takahashi M, et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2008; 48:1219-1224) . Sin embargo, el MAC es un metabolito muy lábil, que se degrada rápidamente en la sangre después de su recolección (Srinivas, N.R. and Mamidi, R.N., Biomedical Chromatography, 2003, 17 (5) :285-291) , por lo tanto se requiere su derivatización en el momento de la recogida de muestras (Takahashi, M. et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2008; 48:1219-1224) . El clopidogrel, (+) - (S) 2- (2-clorofenil) -2- (6, 7-dihidrotieno[3, 2-c]piridina-5 (4H) -yl) acetato de metilo también se metaboliza a un derivado en forma de ácido carboxílico, el SR26334. Este metabolito SR26334 es inactivo y el compuesto mayoritario en la circulación.

En el estado de la técnica se ha descrito el empleo de la cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas en tándem, LC-MS/MS, para el análisis en plasma de clopidogrel (Nirogi R.V.S. et al., Rapid Communications in Mass Spectrometr y , 2006; 20:1695-1700; Robinson, A. et al., Journal of Chromatography B, 2007, 848:344-354; Shin, B.S. and Yoo, S.D., Biomedical Chromatography, 2007, 21:883-889) , de su metabolito inactivo SR26334 (Ksycinska, H. et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2006, 41:533-539) y para el análisis de ambos (Patel, N.K. et al., Journal of Chromatographic Science, 2008, 46:867-875; Reddy, R. et al., Journal of Chromatography B, 2010, 878:502508) . La mayoría de estos métodos emplea un extracción líquido-líquido (Nirogi et al, 2006; Ksycinsca et al, 2006; Robinson et al, 2007; Shin et al, 2007) , uno hace uso de una extracción en fase sólida, (Patel et al, 2008) , y otro utiliza una extracción en fase sólida en línea (Reddy et al, 2010) . Sin embargo, cabe señalar que además de ser procedimientos de extracción caros y de requerir mucho tiempo, ninguno los métodos de monitorización simultánea del clopidogrel y de SR26334 publicados hasta el momento cumplen con los requisitos de la FDA (Food and Drug Administration, 2003) y la EUC (European Union Commission, 2002) para la identificación de compuestos. Estos requisitos son: presencia de dos transiciones por compuesto, y una relación relativa de iones adecuada (±20% si la relación es >50%, ±25% si la realción es 20-50%, ±30% si la relación es 10-20%, y ±50% si es :10%) .

El ácido acetilsalicílico (AAS) inhibe la ciclooxigenasa-1 (Hennekens, C. et al, Circulation, 1989; 80:749-756) . El AAS se hidroliza rápidamente en el cuerpo, teniendo una vida media en plasma de 20 min, para formar el ácido salicílico (AS) , que es el metabolito activo (Reilly I.A. y Fitzgeral G.A., Drugs, 1988; 35 (2) :154-176) . Por tanto, al igual que se ha expuesto para el MAC, la determinación de AAS en la práctica clínica habitual entraña ciertas dificultades.

El ácido salicílico (AS) ha sido analizado en el plasma por LC-MS/MS, junto con ácido acetilsalicílico (AAS) (Bae, S.K., Biomedical Chromatography, 2008, 22:590-595; Xu, X. et al., Biomedical Chromatography, 2009, 23:973-979) , y junto con otros fármacos (Gonzalez, O. et al., Journal of Chromatography B, 2010, 878 (28) : 2685-2692; Hori, Y. et al., Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2006, 29 (1) :7-13; Simonsen, K.W. et al, Journal of Analytical Toxicology, 2010, 35:367-373; Sørensen, L. K., Forensic Science International, 2010, doi:10.1016/j.forsciint.2010.07.016) . Cuatro de los anteriores autores emplearon un procedimiento de precipitación de proteínas (Bae et al, 2008; Gonzalez et al, 2010; Sorensen, 2010;Xu et al, 2009) , Hori (Hori et al, 2006) usó extracción en fase sólida y Simonsen (Simonsen et al, 2010) extracción líquido-líquido. Sin embargo, todos los métodos mostraron límites de cuantificación muy elevados.

A pesar de estos antecedentes, no se ha descrito hasta la fecha ningún método que permita monitorizar de manera simultánea ambos fármacos en plasma ya que el clopidogrel y el AAS (así como sus correspondientes metabolitos) presentan propiedades físico-químicas muy diferentes (básico vs ácido) .

Por consiguiente, teniendo en cuenta que el uso combinado de clopidogrel con ácido acetilsalicílico es una terapia muy habitual en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades cardiovasculares, existe la necesidad de desarrollar un método de análisis para la detección y cuantificación de clopidogrel y ácido acetilsalicílico simultáneamente, ya sea por sí mismos o a través de sus metabolitos, que pudiera ser utilizado como herramienta para comprobar el correcto seguimiento de la terapia. Además, desde el punto de vista de su potencial aplicación industrial, dicho método preferentemente debería ser sencillo y económico, cumpliendo también con las normativas que regulan la identificación de compuestos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores de la presente invención han desarrollado y validado plenamente un método de análisis eficaz para la determinación simultánea y cuantitativa de clopidogrel, SR26334 y AS en plasma empleando cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) . Este método permite llevar a cabo en un mismo procedimiento analítico la detección y cuantificación de todos los compuestos anteriores, empleando además una única y pequeña muestra de plasma, ahorrándose por lo tanto tiempo y recursos económicos. Así mismo, el método que se describe en esta invención es el primero que cumple con los requisitos de la Agencia de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos (FDA) y la Comisión de la Unión Europea (CUE) para la identificación simultánea del clopidogrel y del SR26334.

Por lo tanto, en un aspecto de la presente invención se proporciona un método analítico para la detección y cuantificación simultánea de clopidogrel, ácido salicílico y SR26334 en plasma, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:

a) adición de un patrón interno a una muestra del plasma y separación de las proteínas,

b) análisis de la muestra desproteinizada por cromatografía líquida en tándem con espectrometría de masas (LC-MS/MS) , y

c) comparación de los datos obtenidos en el análisis anterior con los datos proporcionados por disoluciones de calibración.

El método... [Seguir leyendo]

1. Método analítico para la detección y cuantificación simultánea de clopidogrel, ácido salicílico (AS) y SR26334 en plasma, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:

a) adición de un patrón interno a una muestra del plasma y separación de las proteínas,

b) análisis de la muestra desproteinizada por cromatografía líquida en tándem con espectrometría de masas (LC-MS/MS) , y

c) comparación de los datos obtenidos en el análisis anterior con los datos proporcionados por disoluciones de calibración.

2. El método según la reivindicación 1 donde las condiciones de separación cromatográfica son:

- columna cromatográfica de fase reversa C18, sometida al procedimiento de "end-capping", de medidas 50 x 2, 1 mm, 100 x 2, 1 mm o 150 x 2, 1 mm, a una temperatura que puede oscilar entr.

2. 35ºC,

- la fase móvil está formada por ácido fórmico entre 0, 01% y 0, 1% en agua (A) y ácido fórmico entre 0, 01% y 0, 1% en acetonitrilo (B) , siempre y cuando el porcentaje de ácido fórmico en la fase acuosa y en la fase orgánica sea el mismo,

- la velocidad de flujo está comprendida entre 0, 1 y 0, 4 mL/min, y

- el gradiente comienza con una mezcla inicial con un porcentaje de disolvente acuoso (A) mayor del 50% que pasa a una mezcla final con un porcentaje de disolvente orgánico (B) mayor del 50%, para finalmente volver a las condiciones iniciales que se emplean para acondicionar la columna.

3. El método según las reivindicación 2 donde la columna cromatográfica es una columna Atlantis T3 3 μm 100 x 2, 1 mm a 25 ºC.

4. El método según las reivindicaciones 2 y 3 donde la fase móvil está formada por ácido fórmico en agua 0, 1%

(A) + ácido fórmico en acetonitrilo 0, 1% (B) .

5. El método según las reivindicaciones 2-4 donde velocidad de flujo es 0, 2 mL/min.

6. El método según las reivindicaciones 2-5 donde el gradiente comienza con una mezcla inicial de 80% A y 20% B, que pasa en 5 min a 100% B, el cual se mantiene durante 4 min y vuelve a la mezcla inicial en 1 min, siguiendo 4 minutos con la mezcla inicial para equilibrar la columna resultando en un tiempo total de 14 min.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el patrón interno para clopidogrel y SR26334 es diazepam-d5.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el patrón interno para AS es el ácido 6metoxisalicílico.

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la etapa de separación de las proteínas comprende precipitar las proteínas de la muestra.

10. El método según la reivindicación 9 donde la precipitación de las proteínas comprende las etapas de:

i. añadir un disolvente orgánico a la muestra de plasma,

ii. agitar la mezcla anterior

iii. centrifugar la muestra, y

iv. separar el sobrenadante del precipitado.

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el plasma ha sido extraído de pacientes tratados con AAS y/o clopidogrel.

12. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la muestra de plasma tiene un volumen de entre 200 y 300 μL.

13. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la muestra de plasma tiene un volumen de 250 μL.

14. Método para la monitorización simultánea de clopidogrel y AAS en pacientes tratados con dichos compuestos, que comprende el método de detección y cuantificación descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

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