Interferencia de RNA mediada por RNAs de 21 y 22 nt.

Molécula de RNA bicatenario capaz de inhibir la expresión de un gen diana que tiene una cadena sentido y una cadena antisentido,

en donde la cadena sentido o la cadena antisentido está bloqueada en el extremo 3' por un extremo 3' saliente largo, dirigiendo con ello el procesamiento del dsRNA para originarse en el extremo 3' opuesto de la molécula de RNA bicatenario.

Interferencia de RNA mediada por RNAs de 21 y 22 nt.

La presente invención se refiere a moléculas de RNA bicatenario (ds) capaces de mediar la interferencia de 5 RNA específica de la diana.

La expresión "interferencia de RNA" (RNAi) fue acuñada después del descubrimiento de que la inyección de dsRNA en el nematodo C. elegans conduce a silenciación específica de genes altamente homólogos en secuencia al dsRNA administrado (Fire et al., 1998) . Se observó posteriormente también RNAi en insectos, ranas (Oelgeschlager et al., 2000) y otros animales con inclusión de ratones (Svoboda et al., 2000; Wianny y Zernicka-Goetz, 2000) y es probable que exista también en humanos. La RNAi está ligada estrechamente al mecanismo post- transcripcional de silenciación de genes (PTGS) de co-supresión en plantas y muerte en hongos (Catalanotto et al., 2000; Cogoni y Macino, 1999; Dalmay et al., 2000; Ketting y Plasterk, 2000; Mourrain et al., 2000; Smardon et al., 2000) y algunos componentes de la maquinaria de RNAi son necesarios también para la silenciación post- transcripcional por co-supresión (Catalanotto et al., 2000; Dern-burg et al., 2000; Ketting y Plasterk, 2000) . El tópico ha sido revisado también recientemente (Bass, 2000; Bosher y Labouesse, 2000; Fire, 1999; Plasterk y Ketting, 2000; Sharp, 1999; Sijen y Kooter, 2000) , véase también el ejemplar completo de Plant Molecular Biology, vol. 43, número 2/3, (2000) .

En las plantas, además de la PTGS, los transgenes introducidos pueden conducir también a silenciación transcripcional de genes por metilación del DNA de las citosinas dirigida por RNA (véanse referencias en Wasse20 negger, 2000) . Dianas genómicas tan cortas como 30 pb se metilan en las plantas de una manera dirigida por RNA

(Pelissier, 2000) . La metilación de DNA está presente también en los mamíferos.

La función natural de RNAi y la co-supresión parece ser la protección del genoma contra la invasión por elementos genéticos móviles tales como retro-transposones y virus que producen RNA o dsRNA aberrantes en la célula hospedadora cuando aquéllos se vuelven activos (Jensen et al., 1999; Ketting et al., 1999; Ratcliff et al., 1999;

Tabara et al., 1999) . La degradación específica de mRNA previene la replicación de transposones y virus, aunque algunos virus son capaces de vencer o prevenir este proceso por expresión de proteínas que suprimen la PTGS (Lucy et al., 2000; Voinnet et al., 2000) .

El dsRNA desencadena la degradación específica de RNAs homólogos únicamente dentro de la región de identidad con el dsRNA (Zamore et al., 2000) . El dsRNA se procesa a fragmentos de RNA de 21-23 nt y los sitios de 30 escisión del RNA diana están espaciados regularmente con distanciamiento de 21-23 nt. Por esta razón se ha sugerido que los fragmentos de 21-23 nt son los RNAs guía para reconocimiento de dianas (Zamore et al., 2000) . Estos RNAs cortos se detectaron también en extractos preparados a partir de células Schneider 2 de D. melanogaster que se transfectaron con dsRNA antes de la lisis celular (Hammond et al., 2000) ; sin embargo, las fracciones que exhibían actividad de nucleasas específicas de la secuencia contenían también una gran proporción de dsRNA residual. El papel de los fragmentos de 21-23 nt en el guiamiento de la escisión del mRNA está respaldado adicionalmente por la observación de que fragmentos de 21-23 nt aislados de dsRNA procesado son capaces, en cierto grado, de mediar la degradación específica del mRNA (Zamore et al., 2000) . Moléculas de RNA de tamaño similar se acumulan también en tejido de plantas que exhibe PTGS (Hamilton y Baulcombe, 1999) .

En este documento, los autores utilizan el sistema establecido de Drosophila in vitro (Tuschl et al., 1999;

Zamore et al., 2000) para explorar adicionalmente el mecanismo de RNAi. Se demuestra que RNAs cortos de 21 y 22 nt, cuando sus bases están apareadas con extremos salientes 3', actúan como los RNAs guía para la degradación del mRNA específica de la secuencia. Los dsRNAs cortos de 30 pb son incapaces de mediar RNAi en este sistema debido a que ya no se procesan a RNAs de 21 y 22 nt. Adicionalmente, se definieron los sitios de escisión del RNA diana con relación a los RNAs de interferencia cortos de 21 y 22 nt (siRNAs) y proporcionan evidencia de 45 que la dirección del procesamiento de dsRNA determina si un RNA diana sentido o antisentido puede ser escindido por el complejo de endonucleasas siRNP producido. Adicionalmente, los siRNAs pueden ser también herramientas importantes para modulación de la transcripción, v.g. silenciación de genes de mamífero por guiamiento de la metilación del DNA.

Experimentos ulteriores en sistemas de cultivo de células humanas in vivo (células HeLa) demuestran que 50 moléculas de RNA bicatenario que tienen una longitud de preferiblemente 19-25 nucleótidos tienen actividad de RNAi. Así pues, en contraste con los resultados de Drosophila, también moléculas de RNA bicatenario de 24 y 25 nt de longitud son eficientes para RNAi.

El objeto subyacente de la presente invención es proporcionar nuevos agentes capaces de mediar la interferencia de RNA específico de la diana, teniendo dichos agentes una eficacia y seguridad mejoradas comparados con los 55 agentes de la técnica anterior.

La solución a este problema es proporcionada por la materia que constituye el objeto de la serie de reivindicaciones adjuntas que definen la presente invención.

Se describe también una molécula de RNA bicatenario aislada, en la cual cada cadena de RNA tiene una longitud de 19-25, particularmente de 19-23 nucleótidos, en donde dicha molécula de RNA es capaz de mediar modificaciones del ácido nucleico específico de la diana, particularmente interferencia de RNA y/o metilación del DNA. Preferiblemente, al menos una cadena tiene salientes 3' de 1-5 nucleótidos, más preferiblemente de 1-3 nucleótidos y muy 5 preferiblemente de 2 nucleótidos. La otra cadena puede tener extremos romos o tiene un saliente 3' de hasta 6 nucleótidos. Asimismo, si ambas cadenas del dsRNA son exactamente de 21 ó 22 nucleótidos, es posible observar alguna interferencia de RNA cuando ambos extremos son romos (salientes de 0 nt) . La molécula de RNA es preferiblemente una molécula de RNA sintética que está sustancialmente exenta de contaminantes existentes en extractos de células, v.g. de embriones de Drosophila. Adicionalmente, la molécula de RNA está con preferencia sustancial mente exenta de cualesquiera contaminantes no específicos de la diana, particularmente moléculas de RNA no específicas de la diana, v.g. de contaminantes existentes en los extractos celulares.

Se describe adicionalmente el uso de moléculas de RNA bicatenario aisladas, en donde cada cadena de RNA tiene una longitud de 19-25 nucleótidos, para mediación de modificaciones del ácido nucleico específico de la diana, particularmente RNAi, en células de mamífero, particularmente en células humanas.

Sorprendentemente, se ha encontrado que las moléculas cortas sintéticas de RNA bicatenario con extremos salientes 3', son mediadores de RNAi específicos de la secuencia y median la escisión eficiente del RNA diana, estando localizado el sitio de escisión cerca del centro de la región abarcada por el RNA corto de guiamiento.

Preferiblemente, cada cadena de la molécula de RNA tiene una longitud de 20-22 nucleótidos (o 20-25 nucleótidos en células de mamífero) , pudiendo ser la longitud de cada cadena igual o diferente. Preferiblemente, la longitud del saliente 3' alcanza de 1 a 3 nucleótidos, pudiendo ser la longitud del saliente igual o diferente para cada cadena. Las cadenas de RNA tienen preferiblemente grupos 3'-hidroxilo. El término 5' comprende preferiblemente un grupo fosfato, difosfato, trifosfato o hidroxilo. Los dsRNAs más eficaces están compuestos de dos cadenas de 21 nt que están apareadas de tal manera que están presentes salientes 3' de 1-3 nucleótidos, particularmente de 2 nt, en ambos extremos del dsRNA.

La reacción de escisión del RNA diana guiada por siRNAs es altamente específica de la secuencia. Sin embargo, no todas las posiciones de un siRNA contribuyen por igual al reconocimiento de la diana. Los desapareamientos en el centro del dúplex de siRNA son sumamente críticos y anulan esencialmente la escisión del RNA diana. En contraste, el nucleótido 3' de la cadena de siRNA (v.g. la posición 21) que es complementario al RNA diana monocatenario, no contribuye a la especificidad del reconocimiento de la diana. Adicionalmente,... [Seguir leyendo]

1. Molécula de RNA bicatenario capaz de inhibir la expresión de un gen diana que tiene una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde la cadena sentido o la cadena antisentido está bloqueada en el extremo 3' por un extremo 3' saliente largo, dirigiendo con ello el procesamiento del dsRNA para originarse en el extremo 3' opuesto de la molécula de RNA bicatenario.

2. La molécula de RNA de la reivindicación 1, que contiene al menos un análogo de nucleótido modificado.

3. La molécula de RNA de la reivindicación 2, en donde el análogo de nucleótido modificado se selecciona de ribonucleótidos modificados en el azúcar o en la cadena principal.

4. La molécula de RNA de la reivindicación 2 ó 3, en donde el análogo de nucleótido es un ribonucleótido modificado en el azúcar, en donde el grup.

2. OH está reemplazado por un grupo seleccionado de H, OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2 o CN, en donde R es alquilo, alquilo, alquenilo o alquinilo C1-C6 y halo es F, Cl. Br o I.

5. La molécula de RNA de la reivindicación 2 ó 3, en donde el análogo de nucleótido es un ribonucleótido modificado en la cadena principal que contiene un grupo fosfotioato.

6. La molécula de RNA de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que tiene una secuencia que tiene una identidad de al menos 50 por ciento respecto a una molécula diana de mRNA predeterminada.

7. La molécula de RNA de la reivindicación 6, en donde la identidad es al menos 70 por ciento.

8. Un método de preparación de una molécula de RNA bicatenario de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 que comprende los pasos:

(a) sintetizar dos cadenas de RNA, en donde dichas cadenas de RNA son capaces de formar una molécula de RNA bicatenario capaz de inhibir la expresión de un gen diana endógeno que tiene una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde la cadena sentido o la cadena antisentido está bloqueada en el extremo 3' por un extremo 3' largo saliente, dirigiendo con ello el procesamiento del dsRNA para originarse en el extremo 3' opuesto de la molécula de RNA bicatenario, en donde dicha molécula de RNA es susceptible de interferencia de RNA específico de la diana;

(b) combinar las cadenas de RNA sintetizadas en condiciones en las cuales se forma una molécula de RNA bicatenario, que es capaz de inhibir la expresión de un gen diana endógeno.

9. El método de la reivindicación 8, en donde las cadenas de RNA se sintetizan químicamente.

10. El método de la reivindicación 8, en donde las cadenas de RNA se sintetizan enzimáticamente.

11. Un método in vitro de mediación de la interferencia de RNA específico de la diana en una célula eucariota que comprende los pasos:

(a) poner en contacto dicha célula con la molécula de RNA bicatenario de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en condiciones en las cuales puede ocurrir interferencia de RNA específico de la diana, y

(b) mediar una interferencia de RNA específico de la diana efectuada por el RNA bicatenario frente a un ácido nucleico diana que tiene una porción de secuencia que corresponde sustancialmente al RNA bicatenario.

12. Uso del método de la reivindicación 11 para determinación de la función de un gen en una célula.

13. Uso del método de la reivindicación 11 para modulación de la función de un gen en una célula.

14. El uso de la reivindicación 12 ó 13, en donde el gen está asociado con una condición patológica.

15. El uso del método de la reivindicación 14, en donde el gen es un gen asociado a un patógeno.

16. El uso de la reivindicación 15, en donde el gen es un gen viral.

17. El uso de la reivindicación 14, en donde el gen es un gen asociado a un tumor.

18. El uso de la reivindicación 14, en donde el gen es un gen asociado a una enfermedad autoinmune.

19. Composición farmacéutica que contiene como agente activo al menos una molécula de RNA bicatenario de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un portador farmacéutico.

20. La composición de la reivindicación 19 para aplicaciones diagnósticas.

21. La composición de la reivindicación 19 para aplicaciones terapéuticas.

FIGURA 1A

FIGURA 2

pb tiempo (h)

FIGURA 3A

diana sentido diana antisentido FIGURA 3B

diana sentido diana antisentido FIGURA 4A

39 pb

52 pb

111 pb

FIGURA 4B

FIGURA 5A

FIGURA 6A

Fig. 11 Parte III

FIGURA 13

FIGURA 15

diana sentido FIGURA 16

FIGURA 18

Pp-luc/Rr-luc norm.