VECTOR PARA LA SELECCIÓN EFICAZ Y/O MADURACIÓN DE UN ANTICUERPO Y USOS DEL MISMO.

Un vector adecuado para eficiente selección y/o maduración de un anticuerpo recombinante perteneciente al grupo de:

ScFv, fragmentos activos de Abs, secuencias humanizadas de Ab, dicho vector se caracteriza porque i) contiene al menos un elemento capaz de reducir el nivel de expresión del anticuerpo recombinante perteneciente al grupo de: a) un codón de detención suprimido dentro del péptido líder o la secuencia codificadora del anticuerpo; b) un promotor de eficiencia baja que dirige la transcripción de dicha secuencia codificadora del anticuerpo; y ii) tiene una mejor eficacia de despliegue de dicho anticuerpo recombinante por medio de: a) fusión de la secuencia codificadora del anticuerpo recombinante a la secuencia que codifica la parte carboxi-terminal de la proteína pIII; y b) por el uso como péptido líder del péptido líder del anticuerpo recombinante de la fosfatasa alcalina de E. coli; y c) eliminar cualquier codón ámbar entre la secuencia codificadora del anticuerpo recombinante y la secuencia codificadora de pIII, en el que el nivel de expresión del anticuerpo recombinante se puede reducir con un inhibidor del promotor que dirige la transcripción de dicha secuencia codificadora del anticuerpo

La presente invención se refiere a un procedimiento de mejora de la capacidad de selección del anticuerpo en biblioteca de despliegue de fago, en el que dicha mejora se obtiene a través de la reducción de los niveles de expresión de los anticuerpos producidos en dicha biblioteca.

Campo de la invención

La tecnología de ADN recombinante proporciona una alternativa económica y útil para la producción de anticuerpos monoclonales. El despliegue de anticuerpos recombinantes en la cápside del bacteriófago, conocido como despliegue en fago, no solo permite la generación de una biblioteca de anticuerpos humanos para la selección de ligadores específicos, que proporciona anticuerpos útiles para la terapia que no induce una respuesta inmune perjudicial en los pacientes, sino que también facilita la maduración de afinidad de los anticuerpos a través de la construcción de una biblioteca de anticuerpos mutantes, que proporciona clones con mayor afinidad.

La posibilidad de hallar ligadores de alta afinidad en una biblioteca de anticuerpos recombinantes caracteriza su calidad, que depende de varios factores como tamaño, diversidad y fuente de los genes de inmunoglobulina de la biblioteca.

Se sabe que varios tejidos linfoides de donantes inmunizados o no inmunizados, tales como linfocitos de sangre periférica, bazo y médula ósea e incluso tejido de ganglios linfáticos metastático o drenado de individuos afectados por tumores pueden actuar como fuente del repertorio de anticuerpos específicos.

Si bien las bibliotecas de anticuerpos sin tratamiento son más diversas y llevan al aislamiento de especificidades de anticuerpo amplias, es razonable sugerir que la construcción de una biblioteca de anticuerpos recombinantes a partir del repertorio de Ig de un paciente afectado por una enfermedad específica puede proporcionar fragmentos de anticuerpos de mayor afinidad contra antígenos particulares.

Varios estudios publicados describen la construcción de bibliotecas de anticuerpos recombinantes provenientes de ganglios linfáticos asociados con tumor (Clin. Exp. Immunol. 1997 109(1):166-74; Int. J. Mol. Med. 2004 14(4):72935; World J. Gastroenterol. 2004 10 (18):2619-23). Estos estudios se basan en la idea general de que el tejido del ganglio linfático de los pacientes con cáncer está infiltrado con células B activadas, que pueden servir como fuente de anticuerpos específicos de tumor.

Es relativamente difícil obtener ganglios linfáticos metastáticos o drenados de los pacientes con cáncer de mama como material quirúrgico fresco. De acuerdo con la práctica médica reciente el cirujano extirpa solo un ganglio linfático centinela o un pequeño agrupamiento de ganglios (ganglio centinela y los más próximos a este), de este modo se realiza una cirugía menos invasiva y se reducen los efectos secundarios, en vez de extirpar docenas de ganglios linfáticos de acuerdo con la técnica quirúrgica previa. Después de la disección del ganglio linfático centinela, prácticamente se estudia el ganglio entero para determinar la presencia de micrometástasis o células cancerosas únicas. En consecuencia, en la cirugía de cáncer de mama el ganglio metastático está prácticamente no disponible como material quirúrgico descartado.

La evidencia de que los anticuerpos derivados de linfocitos B infiltrantes del tumor (TIL-B) también pueden reconocer células tumorales se obtuvo por la producción de hibridomas humanos, obtenidos de TIL, capaces de secretar anticuerpos específicos de tumor (Lancet. 1982 1(8262):11-4; Br. J. Cancer, 1983 47(1): 135-45); por la expansión de las células B de TIL de las biopsias de tumor humano (Cancer Immunol. Immunother. 1994 38(4):225-32); por la expansión de las células B de TIL derivado de melanoma y posterior clonación del anticuerpo scFv de un clon de células B único con reactividad específica para melanoma (Cancer Res. 1995 55:3584-91); y por transplante subcutáneo de tejido de cáncer pulmonar humano en ratones inmunodeficientes productores de anticuerpos humanos derivados de TIL-B, que reconocieron dos proteínas específicas de tumor (Cancer Invest. 2000;18(6):5306; Cancer Res. 2002 62(6):1751-6), de este modo se sugiere una función específica de TIL-B en el tumor.

Recientemente, el carcinoma cervical y un tipo raro de cáncer de mama, clasificado como carcinoma medular (MCB) han demostrado que se caracterizan por infiltrados linfoplasmacíticos que se correlacionan con mejor pronóstico y supervivencia del paciente. Estas enfermedades se investigaron para entender la naturaleza de los linfocitos B infiltrados en tumores (TIL-B) por el uso también de procedimientos de despliegue en fago. El estudio de la estructura molecular de las regiones variables del anticuerpo proporcionó evidencia de las respuestas inmuno humorales dirigidas por antígeno en los carcinomas de mama medulares, así como en los tumores cervicales. La predominancia oligoclonal hallada en los genes del anticuerpo derivado de los TIL indicó la posible selección clonal de las moléculas de Ig contra neoantígenos específicos sobreexpresados o expresados específicamente, en tejido tumoral (Cancer Immunol. Immunother. 2001 50(10): 523-32; Cancer Res. 2001 61(21):7889-99; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001 98(22):12659-64; J. Immunol. 2002 169 (5):2701-11).

A pesar de las muy importantes indicaciones mencionadas anteriormente de que el tejido tumoral está infiltrado con células B activadas, que pueden servir como fuente de anticuerpos específicos de tumor, varios grupos de investigación, en los experimentos de inmunopurificación realizados con bibliotecas de despliegue en fago derivadas de TIL contra antígenos tumorales conocidos purificados, o células tumorales vivas o secciones de tejido congelado, no pudieron seleccionar ni un anticuerpo específico que discrimine entre células tumorales y normales ni uno reactivo con antígenos tumorales de la superficie celular (Cancer Res. 2001 61(21):7889-99; Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 2001 98(22):12659-64; Int. J. Cancer 2001 93:832-40). Solo más tarde, dos grupos diferentes pudieron identificar anticuerpos específicos que reconocen células tumorales de esta clase de bibliotecas de despliegue en fago (J. Immunol. 2002 169:1829-36; J Immunol. 2005 175(4):2278-85).

Un abordaje alternativo, basado en una biblioteca derivada de tumor con expresión en fago y protocolos de detección en placa directa, que evitan las limitaciones del sistema de despliegue en fago, permitieron a Wu y colegas (Cancer Immunol Immunother. 2002 51 (2): 79-90) aislar múltiples anticuerpos que se unen específicamente a células tumorales cultivadas. Este estudio indica que las dificultades observadas en la selección de anticuerpos anti-tumor de las bibliotecas de despliegue en fago derivadas de TIL provienen de la imperfección de los vectores de despliegue conocidos en la técnica. Sin embargo, la detección directa tampoco es un procedimiento excelente para la selección de anticuerpos recombinantes de una biblioteca grande. En efecto es un procedimiento laborioso que demanda gran cantidad de tiempo y medios, en comparación con la tecnología de despliegue en fago. Barbas et al. (Phage Display: a laboratory manual, ISSN:0-87969-546-3, (2001) páginas I-XVI, 1,1) describen vectores para despliegue en fago (pComb3H y pComb3X) en los que los fragmentos scFv se unen al extremo C de 180 aminoácidos de la proteína de cubierta gpIII (aa230-460) del fago filamentoso. También se describen fagémidos que comprenden promotores de eficiencia baja o reprimibles (plac) en el vector de fagémido y los procedimientos para usar dichos vectores en la selección y maduración del scFv. La solicitud de patente Europea EP 1 452 599 describe vectores para despliegue en fago, fagémidos y bibliotecas de despliegue en fago que despliegan varios péptidos epitópicos o dominios proteicos con potencial para unirse a un material blanco de interés. El documento WO 92/01047 describe un procedimiento de producir un miembro multimérico de un par de unión específica (sbp), que comprende expresar en un organismo huésped recombinante una primera cadena polipeptídica del miembro sbp o una población genéticamente diversa de este tipo de miembro sbp fusionado a un componente de un paquete de despliegue genético replicable secretado (rgdp) que de este modo despliega el polipéptido en la superficie del paquete y que expresa en un organismo huésped recombinante una segunda cadena polipeptídica del multímero y que causa o permite que las cadenas polipeptídicas se unan entre sí para formar el multímero como parte de la rgdp, al menos una de las... [Seguir leyendo]

1. Un vector adecuado para eficiente selección y/o maduración de un anticuerpo recombinante perteneciente al grupo de: ScFv, fragmentos activos de Abs, secuencias humanizadas de Ab, dicho vector se caracteriza porque

i) contiene al menos un elemento capaz de reducir el nivel de expresión del anticuerpo recombinante perteneciente al grupo de: a) un codón de detención suprimido dentro del péptido líder o la secuencia codificadora del anticuerpo; b) un promotor de eficiencia baja que dirige la transcripción de dicha secuencia codificadora del anticuerpo; y

ii) tiene una mejor eficacia de despliegue de dicho anticuerpo recombinante por medio de: a) fusión de la secuencia codificadora del anticuerpo recombinante a la secuencia que codifica la parte carboxi-terminal de la proteína pIII; y b) por el uso como péptido líder del péptido líder del anticuerpo recombinante de la fosfatasa alcalina de E. coli; y c) eliminar cualquier codón ámbar entre la secuencia codificadora del anticuerpo recombinante y la secuencia codificadora de pIII, en el que el nivel de expresión del anticuerpo recombinante se puede reducir con un inhibidor del promotor que dirige la transcripción de dicha secuencia codificadora del anticuerpo.

2. El vector de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el vector es un plásmido, un fagémido o un fago.

3. Un vector de fagémido de acuerdo con la reivindicación 2 que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:

1.

4. Una biblioteca de anticuerpo de despliegue en fago que consiste en el vector de acuerdo con la reivindicación 1 a 3 y ADNc, o secuencias de anticuerpo sintéticas o semisintéticas, incluso mutadas por maduración de afinidad de anticuerpos clonados en dicho vector.

5. La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 4 en la que los ADNc derivan de las células productoras de anticuerpo.

6. La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 5 en la que las células productoras de anticuerpo son Linfocitos infiltrantes de tumor (TILs) o Linfocitos de sangre periférica (PBL).

7. La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 6 en la que las células productoras de anticuerpo se aíslan de un sujeto afectado por tumor.

8. La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 7 en la que el sujeto afectado por tumor es un sujeto afectado de cáncer de mama.

9. Una célula huésped transformada con el vector de acuerdo con la reivindicación 1 a 3.

10. Un método para mejorar la selección y/o maduración de un anticuerpo recombinante que comprende la etapa de clonar y expresar ADNc, o secuencias de anticuerpo sintéticas o semisintéticas, incluso mutadas por maduración de afinidad de los anticuerpos en el vector de acuerdo con la reivindicación 1 a 3.