Biblioteca de ADN focalizada que comprende secuencias de ADN variegadas que codifican:

(1) por lo menos una RDC1 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo constituido por: (a) 1Y23M45, en la que es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; (b) (S/T)1(S/G/X)2(S/G/X)3Y4Y5W6(S/G/X)7. en la que (S/T) es una mezcla 1:1 de los restos S y T, (S/G/X) es una mezcla de 0,2025 S, 0,2025 G y 0,035 de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W e Y; (c) V1S2G3G4S5I6S78910Y11Y12W1314, en la que es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y (d) mezclas de vectores o de paquetes genéticos caracterizados porque presentan cualquiera de las secuencias de ADN anteriores; siendo los miembros de este grupo las únicas RDC1 de cadena pesada presentes en la biblioteca; (2) por lo menos una de entre una RDC2 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo constituido por: (a) ISGGTYADSVKG, en la que es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos Y, R, W, V, G y S; y es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos P, S y G o una mezcla equimolar de P y S; (b) IYADSVKG, en la que es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; es una mezcla equimolar de los restos D, I, N, S, W, Y; y es una mezcla equimolar de los restos S, G, D y N; (c) IGYNPSLKG, en la que es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y y son tal como se definieron anteriormente; (d) IS>GGYYYAASVKG, en la que es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y es 0,27 R y 0,027 de cada uno de ADEFGHIKLMNPQSTVWY; y (e) mezclas de vectores o de paquetes genéticos caracterizados porque presentan cualquiera de las secuencias de ADN anteriores; siendo los miembros de este grupo las únicas RDC2 de cadena pesada presentes en la biblioteca; y (3) por lo menos una de una RDC3 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo constituido por: (a) YYCA21111YFDYWG, en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y 2 es una mezcla equimolar de K y R; (b) YYCA2111111YFDYWG, en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y 2 es una mezcla equimolar de K y R; (c) YYCA211111111YFDYWG, en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y 2 es una mezcla equimolar de K y R; (d) YYCAR111S2S3111YFDYWG, en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y 2 es una mezcla equimolar de S y G; y 3 es una mezcla equimolar de Y y W; (e) YYCA2111CSG11CY1YFDYWG, en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y 2 es una mezcla equimolar de K y R; (f) YYCA211S1TIFG11111YFDYWG, en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y 2 es una mezcla equimolar de K y R; (g) YYCAR111YY2S3344111YFDYWG, en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; 2 es una mezcla equimolar de D y G; y 3 es una mezcla equimolar de S y G; (h) YYCAR1111YC2231CY111YFDYWG, en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; 2 es una mezcla equimolar de S y G; y 3 es una mezcla equimolar de T, D y G; y (i) mezclas de vectores o paquetes genéticos caracterizados porque presentan cualquiera de las secuencias de ADN anteriores; siendo los miembros de este grupo las únicas RDC3 de cadena pesada presentes en la biblioteca

Esta solicitud reivindica los derechos según la § 120 de la USC 35 de la solicitud provisional 60/256.380, presentada el 18 de diciembre de 2001.

La presente invención se refiere a bibliotecas focalizadas de paquetes genéticos que presenta, presenta y expresa o comprende un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas y en conjunto presentan, presentan y expresan o comprenden por lo menos una parte de una diversidad concentrada de la familia. La diversidad concentrada de las bibliotecas de la presente invención comprende tanto la diversidad de secuencias como la diversidad de longitud. En una forma de realización preferida, la diversidad concentrada de las bibliotecas de la presente invención tiende hacia la diversidad natural de la familia seleccionada. En una forma de realización más preferida, las bibliotecas tienden hacia la diversidad natural de los anticuerpos humanos y se caracterizan por la variegación en sus regiones determinantes de complementariedad (“RDC”) de la cadena pesada y la cadena ligera.

Antecedentes de la invención

Actualmente, es práctica corriente en la técnica preparar bibliotecas de paquetes genéticos que presentan individualmente, presentan y expresan o comprenden un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas y en conjunto presentan, presentan y expresan o comprenden por lo menos una parte de la diversidad de aminoácidos de la familia. En muchas bibliotecas corrientes, los péptidos, polipéptidos o proteínas están relacionados con anticuerpos (por ejemplo, Fv monocatenario (scFv), Fv, Fab, anticuerpos o minicuerpos completos (es decir, dímeros constituidos por VH unido a VL)). A menudo, comprenden una o más de las RDC y regiones marco de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos humanos.

Las bibliotecas de péptidos, polipéptidos o proteínas se han producido de muchas maneras en la técnica anterior. Véase por ejemplo, Knappik et al., J. Mol. Biol., 296, págs. 57-86, (2000), que se incorpora a la presente memoria como referencia. Un procedimiento consiste en capturar la diversidad de donantes naturales, ya sean naturales o inmunizados. Otra manera consiste en generar bibliotecas con diversidad sintética. Un tercer procedimiento consiste en una combinación de los dos primeros. Por lo general, la diversidad producida por estos procedimientos se limita a la diversidad de secuencias, es decir, cada miembro de la biblioteca se diferencia de los otros miembros de la familia porque presentan diferentes aminoácidos o variegación en una posición dada en la cadena peptídica, polipeptídica o proteica. Naturalmente diversos péptidos, polipéptidos o proteínas, sin embargo, no se limitan a la diversidad solamente en sus secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, los anticuerpos humanos no se limitan a la diversidad de secuencias en sus aminoácidos, también son variados en las longitudes de sus cadenas de aminoácidos.

Para los anticuerpos, la diversidad de longitud se produce, por ejemplo, durante las reorganizaciones de la región variable. Véase, por ejemplo, Corbett et al., J. Mol. Biol., 270, págs. 587-97, (1997). La unión de los genes V con los genes J, produce la inclusión de un segmento D reconocible en RDC3 en aproximadamente la mitad de las secuencias de anticuerpos con cadena pesada, creando de este modo regiones que codifican longitudes variables de aminoácidos. Lo siguiente puede producirse también durante la articulación de los segmentos génicos del anticuerpo: (i) el final del gen V puede presentar suprimidas o cambiadas de cero a varias bases; (ii) el final del segmento D puede presentar de cero a muchas bases eliminadas o cambiadas; (iii) numerosas bases al azar pueden insertarse entre V y D o entre D y J; y (iv) el extremo 5' de J puede evitarse para eliminar o cambiar varias bases. Estas reorganizaciones dan como resultado antibióticos variados tanto en la secuencia de aminoácidos como en longitud.

Las bibliotecas que contienen solamente diversidad de secuencia de aminoácidos están, por tanto, en desventaja porque no reflejan la diversidad natural de péptidos, polipéptidos o proteínas que la biblioteca pretende simular. Además, la diversidad en longitud puede ser importante para el funcionamiento en última instancia de la proteína, péptido o polipéptido. Por ejemplo, con respecto a una biblioteca que comprende regiones de anticuerpo, muchos de los péptidos, polipéptidos, proteínas presentados, presentados y expresados o compuestos de paquetes genéticos de la biblioteca no pueden doblarse de manera apropiada o su fijación a un antígeno puede resultar desventajosa, si la diversidad tanto en la secuencia como en la longitud no están representadas en la biblioteca.

Otro inconveniente de las bibliotecas de la técnica anterior de paquetes genéticos que presentan, presentan y expresan, o comprenden péptidos, polipéptidos y proteínas es que no están focalizados en los miembros que están basados en la diversidad natural y por tanto en los miembros que es más probable que sean funcionales. Más bien, las bibliotecas de la técnica anterior, por lo general, intentan incluir tanta diversidad o variegación en cada resto de aminoácido como sea posible. Esto hace que la construcción de la biblioteca emplee mucho tiempo y sea menos eficiente de lo posible. El número de miembros que se producen tratando de capturar la diversidad completa también hace la identificación más problemática que lo que sería necesario. Esto es particularmente cierto dado que muchos miembros de la biblioteca no serán funcionales.

Sumario de la invención

Un objeto de la presente invención son las bibliotecas de vectores o paquetes genéticos focalizados que codifican miembros de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas en el que las bibliotecas codifican poblaciones que son variadas tanto en longitud como en secuencias. La diversa longitud que comprende componentes que contienen motivos que probablemente son para plegar y funcionar en el contexto del péptido, polipéptido o proteína original.

Otro objeto de la presente invención son las bibliotecas focalizadas de paquetes genéticos que presentan, presentan y expresan o comprenden un miembro de una familia de péptidos, polipéptidos o proteínas y en conjunto presentan, presentan y expresan o comprenden por lo menos una parte de la diversidad focalizada de la familia. Estas bibliotecas son variadas no solamente en sus secuencias de aminoácidos, sino también en sus longitudes. Y, su diversidad está focalizada para que simulen más estrechamente o consideren la diversidad natural de la familia específica que representa la biblioteca.

Otro objeto de la presente invención son las poblaciones variadas, pero focalizadas, secuencias de ADN que codifican péptidos, polipéptidos o proteínas adecuados para presentar o presentar y expresar utilizando paquetes genéticos (tal como fagos o fagómidos) u otros regímenes que permiten la selección de los componentes de la fijación específica de una biblioteca.

Un objeto adicional de la presente invención son las bibliotecas focalizadas que comprenden las RDC de anticuerpos humanos que presentan una diversidad en sus secuencias de aminoácidos y en sus longitudes (ejemplos de dichas bibliotecas incluyen bibliotecas de Fv monocatenario (scFv), Fv, Fab, anticuerpos completos o minicuerpos (es decir, dímeros que constan de VH unida a VL)). Dichas regiones pueden ser de cadena pesada o ligera o ambas o pueden incluir una o más de las RDC de estas cadenas. Más preferentemente, la diversidad de la variación se produce en todas las RDC de cadena pesada y cadena ligera.

La presente invención se refiere a:

Una biblioteca de ADN focalizada que comprende secuencias de ADN variegadas que codifican:

1) por lo menos una RDC1 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo constituido por:

(a) <1>1Y2<1>3M4<1>5, en el que <1> es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y;

(b) (S/T)1(S/G/X)2(S/G/X)3Y4Y5W6(S/G/X)7.

en la que (S/T) es una mezcla 1:1 de restos S y T, (S/G/X) es una mezcla de 0,2025 S, 0,2025 G y 0,035 de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W e Y;

(c) V1S2G3G4S5I6S7<1>8<1>9<1>10Y11Y12W13<1>14, en los que <1> es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y

(d) mezclas de vectores o de paquetes... [Seguir leyendo]

1. Biblioteca de ADN focalizada que comprende secuencias de ADN variegadas que codifican:

(1) por lo menos una RDC1 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo constituido por:

(a) <1>1Y2<1>3M4<1>5, en la que <1> es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y;

(b) (S/T)1(S/G/X)2(S/G/X)3Y4Y5W6(S/G/X)7.

en la que (S/T) es una mezcla 1:1 de los restos S y T, (S/G/X) es una mezcla de 0,2025 S, 0,2025 G y 0,035 de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W e Y;

(c) V1S2G3G4S5I6S7<1>8<1>9<1>10Y11Y12W13<1>14, en la que <1> es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y

(d) mezclas de vectores o de paquetes genéticos caracterizados porque presentan cualquiera de las secuencias de ADN anteriores;

siendo los miembros de este grupo las únicas RDC1 de cadena pesada presentes en la biblioteca;

(2) por lo menos una de entre una RDC2 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo constituido por:

(a) <2>I<2><3>SGG<1>T<1>YADSVKG, en la que <1> es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; <2> es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos Y, R, W, V, G y S; y <3> es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos P, S y G o una mezcla equimolar de P y S;

(b) <1>I<4><1><1><G><5><1><1><1>YADSVKG, en la que <1> es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; <4> es una mezcla equimolar de los restos D, I, N, S, W, Y; y <5> es una mezcla equimolar de los restos S, G, D y N;

(c) <1>I<4><1><1>G<5><1><1>YNPSLKG, en la que <1> es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y <4> y <5> son tal como se definieron anteriormente;

(d) <1>I<8>S><1><1><1>GGYY<1>YAASVKG, en la que <1> es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y <8> es 0,27 R y 0,027 de cada uno de ADEFGHIKLMNPQSTVWY; y

(e) mezclas de vectores o de paquetes genéticos caracterizados porque presentan cualquiera de las secuencias de ADN anteriores;

siendo los miembros de este grupo las únicas RDC2 de cadena pesada presentes en la biblioteca; y

(3) por lo menos una de una RDC3 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo constituido por:

(a) YYCA21111YFDYWG, en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y 2 es una mezcla equimolar de K yR;

(b) YYCA2111111YFDYWG, en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S,T, V, W e Y; y 2 es una mezcla equimolar de K y R;

(c) YYCA211111111YFDYWG, en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y 2 es una mezcla equimolar de K y R;

(d) YYCAR111S2S3111YFDYWG, en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S,T, V, W e Y; y 2 es una mezcla equimolar de S y G; y 3 es una mezcla equimolar de Y y W;

(e) YYCA2111CSG11CY1YFDYWG, en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y 2 es una mezcla equimolar de K y R;

(f) YYCA211S1TIFG11111YFDYWG, en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; y 2 es una mezcla equimolar de K y R;

(g) YYCAR111YY2S3344111YFDYWG, en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; 2 es una mezcla equimolar de D y G; y 3 es una mezcla equimolar de S y G;

(h) YYCAR1111YC2231CY111YFDYWG, en la que 1 es una mezcla equimolar de cada uno de los restos de aminoácidos A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; 2 es una mezcla equimolar de S y G; y 3 es una mezcla equimolar de T, D y G; y

(i) mezclas de vectores o paquetes genéticos caracterizados porque presentan cualquiera de las secuencias de ADN anteriores;

siendo los miembros de este grupo las únicas RDC3 de cadena pesada presentes en la biblioteca.

2. Biblioteca focalizada según la reivindicación 1, en la que las RDC1 de cadena pesada (a), (b) y (c) están presentes en la biblioteca en la relación 0,80:0,17:0,02.

3. Biblioteca focalizada según la reivindicación 1, en la que una mezcla de las RDC2 de cadena pesada (a)/(b) (equimolar), (c) y (d) están presentes en la biblioteca en una relación de 0,54:0,43:0,03.

4. Biblioteca focalizada según la reivindicación 1, en la que 1 en una o la totalidad de las RDC3 de cadena pesada

(a) hasta (h) es 0,095 de cada una de G e Y y 0,048 de cada una de A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V y W.

5. Biblioteca focalizada según la reivindicación 1, en la que las RDC3 de cadena pesada (a) hasta (h) están presentes en la biblioteca en las proporciones siguientes:

(a) 0,10

(b) 0,14

(c) 0,25

(d) 0,13

(e) 0,13

(f) 0,11

(g) 0,04 y

(h) 0,10.

6. Biblioteca focalizada según la reivindicación 1, en la que las RDC3 de cadena pesada (a) hasta (h) están presentes en la biblioteca en las proporciones siguientes:

(a) 0,02

(b) 0,14

(c) 0,25

(d) 0,14

(e) 0,14

(f) 0,12

(g) 0,08 y

(h) 0,11.

7. Biblioteca de ADN focalizada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además las secuencias de ADN variegadas que codifican por lo menos uno de entre:

(1) por lo menos una de una RDC1 de cadena ligera kappa seleccionada de entre el grupo constituido por:

(a) RASQ<1>V<2><2><3>LA

(b) RASQ<1>V<2><2><2><3>LA;

en la que <1> es una mezcla equimolar de los restos de aminoácidos ADEFGHIKLMNPQRSTVWY; <2> es 0,2 S y 0,044 de cada uno de ADEFGHIKLMNPQRTVWY; y <3> es 0,2 Y y 0,044 cada uno de ADEFGHIKLMNPQRTVW e Y; y

(c) mezclas de los vectores o paquetes genéticos caracterizados porque presentan cualquiera de las secuencias de ADN anteriores;

(2) una RDC2 de cadena ligera kappa que presenta la secuencia:

siendo los miembros de este grupo las únicas RDC1 de cadena ligera kappa presentes en la biblioteca;

<1>AS<2>R<4><1>

en la que <1> es una mezcla equimolar de los restos de aminoácidos ADEFGHIKLMNPQRSTVWY; <2> es 0,2 S y 0,044 de cada uno de ADEFGHIKLMNPQRTVWY; y <4> es 0,2 A y 0,044 cada uno de DEFGHIKLMNPQRSTVWY;

siendo los miembros de este grupo las únicas RDC1 de cadena ligera kappa presentes en la biblioteca; o

(3) por lo menos una RDC3 de cadena ligera kappa seleccionada de entre el grupo constituido por:

(a) QQ<3><1><1><1>P<1>T,

en la que <1> es una mezcla equimolar de los restos de aminoácidos ADEFGHIKLMNPQRSTVWY; <3> es 0,2 Y y 0,044 de cada uno de ADEFGHIKLMNPQRTVW;

(b) QQ33111P, en la que 1 y 3 son tal como se definieron en (1) anteriormente;

(c) QQ3211PP1T, en la que 1 y 3 son tal como se definieron en (1) anteriormente y 2 es 0,2 S y 0,044 de cada uno de ADEFGHIKLMNPQRTVWY; y

(d) mezclas de los vectores o paquetes genéticos caracterizados porque presentan cualquiera de las secuencias de ADN anteriores;

siendo los miembros de este grupo las únicas RDC3 de cadena ligera kappa presentes en la biblioteca.

8. Biblioteca de ADN focalizada según la reivindicación 7, que comprende las secuencias de ADN variegadas que codifican por lo menos un miembro de por lo menos dos de los grupos (1), (2) y (3) de la RDC de cadena ligera kappa.

9. Biblioteca de ADN focalizada según la reivindicación 7, que comprende las secuencias de ADN variegadas que codifican por lo menos un miembro de todos los grupos (1), (2) y (3) de la RDC de cadena ligera kappa.

10. Biblioteca focalizada según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que las RDC1 (a) y (b) de cadena ligera kappa están presentes en la biblioteca en una proporción de 0,68:0,32.

11. Biblioteca focalizada según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que las RDC3 (a), (b) y (c) de cadena ligera kappa están presentes en la biblioteca en una proporción de 0,65:0,1:0,25.

12. Biblioteca de ADN focalizada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende además las secuencias de ADN variegadas que codifican por lo menos uno de entre:

(1) por lo menos una RDC1 de cadena ligera lambda seleccionada de entre el grupo constituido por:

(a) TG<1>SS<2>VG<1><3><2><3>VS, en la que <1> es 0,27 T, 0,27 G y 0,027 cada ADEFHIKLMNPQRSVWY,

<2> es 0,27 D, 0,27 N y 0,027 cada AEFGHIKLMPQRSTVWY y <3> es 0,36 Y y 0,036 cada ADEFGHIKLMNPQRSTVW;

(b) G<2><4>L<4><4><4><3><4><4>, en la que <2> es tal como se definió en (1) anteriormente y <4> es una mezcla equimolar de los restos de aminoácidos ADEFGHIKLMNPQRSTVWY; y

(c) mezclas de los vectores o paquetes genéticos caracterizados porque presentan cualquiera de las secuencias de ADN anteriores;

siendo los miembros de este grupo las únicas RDC1 de cadena ligera lambda presentes en la biblioteca;

(2) una RDC2 de cadena ligera lambda que presenta la secuencia: <4><4><4><2>RPS,

en la que <2> es 0,27 D, 0,27 N y 0,027 cada AEFGHIKLMPQRSTVWY y <4> es una mezcla equimolar de los restos de aminoácidos ADEFGHIKLMNPQRSTVW; siendo los miembros de este grupo las únicas RDC2 de cadena ligera lambda presentes en la biblioteca;

(3) por lo menos una de una RDC3 de cadena ligera lambda seleccionada de entre el grupo constituido por:

(a) <4><5><4><2><4>S<4><4><4><4>V, en la que <2> es 0,27 D, 0,27 N y 0,027 cada AEFGHIKLMPQRSTVWY; <4> es una mezcla equimolar de los restos de aminoácidos ADEFGHIKLMNPQRSTVW; y <5> es 0,36 S y 0,0355 cada ADEFGHIKLMNPQRTVWY;

(b) <5>SY<1><5>S<5><1><4>V, en la que <1> es una mezcla equimolar de ADEFGHIKLMNPQRSTVWY; y <4> y <5> son tal como se definieron en (1) anteriormente; y

(c) mezclas de los vectores o de paquetes genéticos caracterizados porque presentan cualquiera de las secuencias de ADN anteriores;

siendo los miembros de este grupo las únicas RDC3 de cadena ligera lambda presentes en la biblioteca.

13. Biblioteca de ADN focalizada según la reivindicación 12, que comprende las secuencias de ADN variegadas que codifican por lo menos un miembro de entre por lo menos dos de los grupos (1), (2) y (3) de RDC de cadena ligera lambda.

14. Biblioteca de ADN focalizada según la reivindicación 12, que comprende las secuencias de ADN variegadas que codifican por lo menos un miembro de cada uno de los grupos (1), (2) y (3) de RDC de cadena ligera lambda.

15. Biblioteca focalizada según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en la que las RDC1 (a) y (b) de cadena ligera lambda están presentes en la biblioteca en una proporción de 0,67:0.33.

16. Biblioteca focalizada según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en la que las RDC3 (a) y (b) de cadena ligera lambda están presentes en la biblioteca en una mezcla equimolar.