Uso de un fagémido que comprende ADN que codifica una proteína de fusión anticuerpo-proteína pIII de colifago en el que la proteína pIII de colifago comprende el dominio amino terminal y el dominio carboxi terminal de una proteína pIII de colifago para seleccionar anticuerpos que inhiben la unión del ligando al receptor

Fagémidos para el cribado de anticuerpos.

La presente invención se refiere a fagémidos para la selección de anticuerpos específicos a partir de bibliotecas recombinantes grandes, a la producción de estos fagémidos y a su uso para seleccionar anticuerpos específicos a partir de bibliotecas recombinantes grandes usando pequeñas cantidades de antígeno.

Las bibliotecas de anticuerpos en plásmidos y fagos se han establecido en E. coli a partir de familias de inmunoglobulinas amplificadas por PCR después de una inmunización. Los anticuerpos recombinantes frente a inmunógenos se seleccionaron por un ensayo ELISA del sobrenadante bacteriano a partir de colonias bacterianas aisladas (Ward, E.S., Güssow, D., Griffiths, A.D., Jones, P.T. y Winter, G.: "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli", Nature 341 (1989) 544-546) o por cribado de réplicas de la placa de colonias bacterianas en nitrocelulosa para detectar la reactividad frente a los inmunógenos marcados radiactivamente (Huse, W.D., Sastry, L., Iverson, S.A., Kang, A.S., Alting-Mees, M., Burton, D.R., Benkovic, S.J. y Lerner, R.A.: "Generation of a large combinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda", Science 246 (1989) 1275-1281). Sin embargo, para la selección de anticuerpos específicos a partir de bibliotecas de cadenas ligeras y pesadas combinadas aleatoriamente de animales no inmunizados que no contienen un predominio de anticuerpos frente a un antígeno particular, se requiere un procedimiento para cribar millones de bacterias que producen anticuerpos.

Una forma posible de cribar un amplio rango de anticuerpos es unir anticuerpos recombinantes a la superficie de bacterias o bacteriófagos de manera que puedan seleccionarse rápidamente por antígenos unidos a una fase sólida. Dadas las dificultades de dirigir proteínas a la superficie celular de las bacterias, un candidato atractivo debido a su pequeño tamaño y su sencilla estructura genética es la familia M13 de bacteriófagos filamentosos (para revisiones véanse Webster, R.E. y Lopez, J. en "Virus Structure and Assembly" ed. S. Casjens, publ. Jones y Bartlett Inc., Boston/Portala Valley, EEUU, 1985; Day, L.A., Marzec, C.J., Reisberg, S.A. y Casadevall, A.: "DNA packaging in filamentous bacteriophages", Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 17 (1988) 509-539).

Kang et al. (PNAS 1991, vol. 88, p 4363-4366) describe un método para el desarrollo y análisis rápido de bibliotecas de Fab de anticuerpo combinatorias, que se basa en un vector fagémido con fagos auxiliares.

WO 88/06630 se refiere a organismos modificados genéticamente que presentan un producto expresado de un gen insertado en su superficie. En particular, se describe un anticuerpo monocatenario que se presenta en la superficie de un microorganismo modificado genéticamente.

El producto del gen III (pIII) es una molécula relativamente flexible y accesible compuesta por dos dominios funcionales; un dominio amino terminal que se une al pilus F de bacterias masculinas durante la infección y un dominio carboxilo terminal incluido en el virión que es importante para la morfogénesis. Pueden insertarse péptidos entre los dos dominios de pIII (Smith, G.P.: Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 228 (1985) 1315-1317) o cerca del N terminal (Parmley, S.F. y Smith, G.P.: Antibody-selectable filamentous fd phage vectors: affinity purification of target genes. Gene, 73 (1988) 305-318) sin destruir sus funciones en la morfogénesis y la infección. Después de mucho trabajo pionero en el uso de pIII en fagos fd para transportar péptidos extraños, Parmely y Smith (1988, loc. cit.) mostraron que los epítopos peptídicos insertados en el extremo amino terminal podían unir fagos a anticuerpos inmovilizados. Como consecuencia de este trabajo, ha sido posible generar bibliotecas peptídicas que pueden cribarse para detectar la unión a ligandos y anticuerpos (Scott, J.K. y Smith, G.P.: Searching for peptide ligands with an epitope library. Science 249 (1990) 386-390; Devlin, J.J., Panganiban, L.C. y Devlin, P.E.: Random peptide libraries: A source of specific protein binding molecules. Science 249 (1990) 404-406; Cwirla, S.E., Peters, E.A., Barrett, R.W. y Dower, W.J. Peptides on phage, a vast library of peptides for identifying ligands.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990) 6378-6382).

McCafferty, J., Griffiths, A.D., Winter, G. y Chiswell, D.J.: Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature, 348 (1990) 552-554 publicaron el ensamblaje de una proteína de fusión anticuerpo-pIII en un fago fd con un gen Tet^R después de insertar ADN de anticuerpo en el extremo 5' del gen III. El fago permaneció infeccioso y fue posible enriquecerlo por cromatografía de afinidad. Sin embargo, se ha mostrado que los fagos de fusión son útiles principalmente para insertos relativamente pequeños, probablemente porque los insertos grandes tienen un efecto adverso en la función de infectividad de pIII (Parmlee y Smith, 1988, loc. cit.). Existe un riesgo elevado, por lo tanto, de que las bibliotecas de fagos se encuentren rápidamente dominadas por mutantes de deleción después de la amplificación de la biblioteca.

Así, el problema técnico subyacente de la presente invención es proporcionar un medio más eficaz para cribar bibliotecas de anticuerpos en bacterias.

Este problema se resuelve proporcionando un fagémido según la reivindicación 1 que expresa una proteína de fusión anticuerpo-pIII funcional. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monocatenario.

El ADN que codifica una proteína de fusión anticuerpo-pIII, preferiblemente una proteína de fusión anticuerpo monocatenario-pIII, se incorporó en un fagémido. Una ventaja importante del sistema de fagémido de esta invención respecto a McCafferty et al. (véase anteriormente) es que puede propagarse como un plásmido y no está bajo ninguna presión de selección para eliminar el ADN del anticuerpo, ya que la expresión de la proteína de fusión está fuertemente reprimida. Esto es particularmente importante durante la amplificación de las bibliotecas de anticuerpo cuando los mutantes de deleción que proliferan muy rápido pueden dominar rápidamente. El ADN del fagémido, que es menor que la mitad del tamaño del ADN de fago anterior, también transforma bacterias más eficazmente. Además, en contraste con el sistema de fago mencionado anteriormente, se producen grandes cantidades del ADN de fagémido más pequeño y están disponibles grandes cantidades de proteína de anticuerpo después de la inducción, facilitando así en gran medida su análisis.

La expresión de la proteína de fusión anticuerpo-pIII, particularmente la proteína de fusión anticuerpo monocatenario-pIII, usando el fagémido pSEX y su empaquetamiento en partículas virales facilitan el establecimiento de sistemas bacterianos para el aislamiento de anticuerpos de alta afinidad. Ahora pueden cribarse rápidamente millones de clones que producen anticuerpos a partir de bibliotecas de anticuerpos por unión al antígeno inmovilizado. Una ventaja adicional respecto a los métodos de cribado convencionales es que sólo se requieren cantidades pequeñas de antígeno, un factor importante cuando el suministro de una proteína poco común es limitado. Este sistema también ofrece la posibilidad de cribar anticuerpos mutados aleatoriamente con el fin de incrementar sus afinidades de unión. El procedimiento puede repetirse muchas veces hasta que se consiga la especificidad deseada. Ahora es factible por primera vez llevar a cabo análisis de cribado diferencial a gran escala de células y organismos relacionados. Una selección sustractiva, p.ej., usando células normales y neoplásicas, puede usarse para identificar antígenos asociados a tumores. El sistema de fagémido también se muestra extremadamente útil para investigar interacciones moleculares p.ej. seleccionando anticuerpos que inhiban la unión del ligando al receptor.

Además, el sistema de esta invención se ha mostrado útil para presentar otras proteínas o péptidos en las superficies de partículas virales de fagémidos. Para este propósito, el ADN del anticuerpo tiene que reemplazarse con ADN del polipéptido deseado.

Los Ejemplos siguientes ilustran la presente invención.

Ejemplo 1

Construcción de un fagémido (pSEX)

Los ADN que codifican un anticuerpo monocatenario...

1. Uso de un fagémido que comprende ADN que codifica una proteína de fusión anticuerpo-proteína pIII de colifago en el que la proteína pIII de colifago comprende el dominio amino terminal y el dominio carboxi terminal de una proteína pIII de colifago para seleccionar anticuerpos que inhiben la unión del ligando al receptor.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monocatenario.