GENERACIÓN DE PROTEINAS DE UNIÓN SINTÉTICAS BASADAS EN PROTEINAS DE UBIQUITINA.

Procedimiento para la preparación de una proteína, presentando el procedimiento las siguientes etapas:

a) seleccionar una proteína que se va a modificar del grupo de proteínas constituido por ubiquitina, SUMO-1, FAU, NEDD-8, UBL-1, Rub1, APG8, ISG15, URM1, HUB1, GDX, elongina B, PLIC2 (dominio N-terminal), parquina humana (dominio N-terminal); b) seleccionar una pareja de unión; c) determinar los aminoácidos expuestos en la superficie de la proteína de la etapa a); d) seleccionar posiciones de aminoácidos en al menos una región expuesta en la superficie de la proteína, que incluye al menos una hebra en lámina plegada beta de la región en lámina plegada beta y de forma opcional regiones en lámina plegada no beta; e) modificar las posiciones de aminoácidos seleccionadas mediante sustitución, inserción, deleción y/o modificación química, conservando el motivo de plegamiento de tipo ubiquitina; f) poner en contacto la proteína modificada con la pareja de unión determinado en la etapa b); g) detectar aquellas proteínas que presentan una afinidad de unión, expresada en KD, por la pareja de unión predeterminada de 10 -5 M a 10 -12 M frente a la pareja de unión predeterminada en la etapa b), y que presentando modificaciones tales, que forman una región continua de 5 a 10 aminoácidos sobre la superficie de la proteína, en la que al menos se encuentran modificados cuatro aminoácidos expuestos en la superficie en la región en lámina plegada beta

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de proteínas modificadas que presentan un motivo de plegamiento de tipo ubiquitina, presentando la proteína basada en esta modificación una afinidad de unión no presente previamente frente a una pareja de unión predeterminada. La ubiquitina es una proteína pequeña, monomérica y citosólica, que aparece – con muy alta conservación de su secuencia – se encuentra en todas las células eucarióticas conocidas, desde los protozoos hasta los vertebrados. Juega en el organismo un papel básico en la regulación de la degradación controlada de proteínas propias de la célula. A este respecto las proteínas determinadas para la degradación se unen en el transcurso de una cascada enzimática covalentemente con ubiquitina o cadenas de poliubiquitina y se degradan selectivamente debido a este marcado. Según las revelaciones más recientes la ubiquitina o la marca de proteínas con ubiquitina juega también un importante papel en otros procesos celulares como en la importación de muchas proteínas o su regulación génica (Marx, 2002).

Además de la clarificación de su función fisiológica la ubiquitina es sobre todo debido a sus propiedades estructurales y químico-proteicas objeto de investigación. La cadena de polipéptidos de la ubiquitina se compone de 76 aminoácidos que están plegados en una estructura alfa/beta extraordinariamente compacta (Vijay-Kumar, 1987): aproximadamente el 87% de la cadena de polipéptidos toma parte mediante puentes de hidrógeno en la formación de los elementos estructurales secundarios. Como estructuras secundarias prominentes pueden servir vueltas helicoidales de tres y medio así como un plegamiento de lámina beta antiparalelo constituido por cuatro hebras. La disposición característica de estos elementos – un plegamiento de lámina beta antiparalelo expuesto en una superficie de la proteína, que se recubre sobre su parte posterior por una hélice alfa que se encuentra verticalmente sobre la misma, -es válido por lo general como el denominado motivo de plegamiento de tipo ubiquitina. La ubiquitina da por tanto nombre a la superfamilia de proteínas correspondiente ("proteínas de tipo ubiquitina") o familia de proteínas ("proteínas relacionadas con ubiquitina") (Murzin y col., 1995), proteínas tales como, por ejemplo, SUMO-1 (Müller y col., 2001), FAU (Michiels y col., 1993), NEDD-8 (Kumar y col., 1993), UBL-1 (Jones y Candino, 1993) y GDX (Filippi y col., 1990), que comprenden este motivo y un grado de identidad alto con la ubiquitina en su secuencia primaria. Una característica adicional de la estructura es una región hidrófoba remarcada en el interior de la proteína entre la hélice alfa y el plegamiento beta.

La preparación sintética de ubiquitina es posible debido a su pequeño tamaño tanto mediante síntesis química como también mediante procedimientos de ingeniería genética. Debido a las propiedades de plegamiento favorables la ubiquitina se puede producir mediante ingeniería genética con ayuda de microorganismos como, por ejemplo Escherichia coli en cantidades relativamente grandes opcionalmente en el citosol o el espacio periplasmático. Esta última estrategia se reserva debido al mildeu oxidante que domina en el periplasma habitualmente para la producción de proteínas secretoras. La preparación bacteriana simple y eficiente hace posible el uso de ubiquitina como pareja de fusión para otras proteínas extrañas que se tienen que preparar, cuya producción es problemática. Mediante la fusión con ubiquitina se puede logar una solubilidad mejorada y con ello un mejor rendimiento. El resultado obtenido en la presente invención de proporcionar ubiquitina como proteína de unión sintética universal hace posible un aprovechamiento completamente nuevo de sus propiedades químico-proteicas.

Entre aquellas proteínas, cuya función natural se usa para fines sintéticos – por ejemplo en biotecnología, bioanalítica o en medicina, son de especial relevancia los anticuerpos (es decir, las inmunoglobulinas). Debido a su capacidad para la unión específica no covalente próxima a cualquier sustancia deseada, estas representan la herramienta más importante para cualquier uso bioeconómico que requiera un reconocimiento, unión o separación de ligandos, receptores o moléculas diana de este tipo. Los procedimientos desarrollados en los últimos años para la biosíntesis funcional de fragmentos de anticuerpos en E. coli han ampliado el campo de aplicación de inmunoglobulinas, a la vez que también han hecho visibles las dificultades y límites.

Además de los fragmentos Fab y Fv que se obtienen en principio también mediante procedimientos químico-proteicos convencionales (Skerra y Plückthun, 1988) se podrían desarrollar con ayuda de procedimientos de ingeniería genética y en base a la constitución modular de las inmunoglobulinas diversas construcciones sintéticas (revisión de Dübel y Kontermann, 2001). Son de resaltar aquí fragmentos Fv de cadena simple (scFv) (Bird y col., 1988), fragmentos Fv de puentes disulfuro (dsFv) (Brinkmann y col., 1993) así como fragmentos de anticuerpos bivalentes (Carter y col., 1992) o biespecíficos (por ejemplo, Diabodies, Holliger y col., 1993). Para el diagnóstico y el uso en la terapia se pueden obtener mediante fusión genética de los fragmentos Ig recombinantes con módulos efectores proteínas bifuncionales. De este modo se disponen entre otros de fusiones con la fosfatasa alcalina (Muller y col., 1999) y la proteína de fluorescencia verde (GFP; Griep y col., 1999). Potencialmente son de mayor importancia fusiones de fragmentos de anticuerpos con radioisótopos o sustancias citotóxicas para el tratamiento de cáncer (inmunotoxinas; Reiter y Pastan, 1998). A este respecto se aprovecha la unión selectiva de fragmentos de Ig correspondientes en proteínas de superficie específicas sobre células tumorales para la aplicación dirigida específica del sitio de agentes terapéuticos (dirigida al tumor).

Los procedimientos para la preparación de fragmentos de anticuerpos en E. coli no hacen posible sin embargo sólo la preparación para diagnóstico y terapia en mejor calidad y cantidad, sino también la modificación sencilla y rápida de sus propiedades químico-proteicas e inmunoquímicas. La facilidad de manipulación de un huésped bacteriano permite la modificación no complicada de genes codificados por vectores de la proteína extraña con procedimientos biológico-moleculares convencionales. Mediante ingeniería de anticuerpos dirigida (Kontermann y Dübel, 2001) se pueden optimizar fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, en lo que respecta a su afinidad de unión o a su compatibilidad con huéspedes. Igualmente se pueden producir anticuerpos específicos o sus fragmentos contra distintas sustancias diana como estructuras de bajo peso molecular o, por ejemplo, proteínas sintéticamente, es decir, fuera del sistema inmune. Con procedimientos evolutivos de este tipo se preparan mediante la incorporación de mutaciones aleatorias bibliotecas sintéticas de fragmentos de anticuerpos, que pueden aproximarse en su extensión al repertorio humano (Knappik y col., 2000). Mediante estrategias de selección adecuadas como presentación en fago o presentación en ribosoma (Winter, 1998, Hoogenboom y col., 1998; Hanes y col., 2000) se aíslan en el caso de éxito fragmentos Ig funcionales con la propiedad de unión deseada. De esta forma es también posible obtener, por ejemplo, proteínas de unión para antígenos tales que provocaron con una inmunización clásica efectos tóxicos o sólo una respuesta inmune débil.

A pesar del éxito y posibilidades citadas que ofrece la ingeniería de anticuerpos, determinadas desventajas pueden limitar la aplicación práctica de anticuerpos. Así la preparación de cantidades suficientes es problemática: la producción de anticuerpos funcionales tiene lugar en sistemas de cultivo celular eucarióticos – un procedimiento de extraordinario coste –. Adicionalmente muchas aplicaciones terapéuticas presentan el inconveniente de la baja penetración en tejido de las moléculas de anticuerpo debido a su tamaño o bien su prolongado tiempo de residencia en el suero (aclaramiento en sangre lento). Se pueden preparar fragmentos más pequeños de anticuerpos como fragmentos scFv o Fab (véase anteriormente) en concreto por vía bacteriana y por tanto de coste en principio favorable, debido a sus propiedades de plegamiento favorables y la necesaria formación de varios puentes disulfuro los rendimientos de la producción recombinante se encuentran frecuentemente por debajo del nivel deseado. Adicionalmente los fragmentos... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la preparación de una proteína, presentando el procedimiento las siguientes etapas:

a) seleccionar una proteína que se va a modificar del grupo de proteínas constituido por ubiquitina, SUMO-1, FAU, NEDD-8, UBL-1, Rub1, APG8, ISG15, URM1, HUB1, GDX, elongina B, PLIC2 (dominio N-terminal), parquina humana (dominio N-terminal);

b) seleccionar una pareja de unión;

c) determinar los aminoácidos expuestos en la superficie de la proteína de la etapa a);

d) seleccionar posiciones de aminoácidos en al menos una región expuesta en la superficie de la proteína, que incluye al menos una hebra en lámina plegada beta de la región en lámina plegada beta y de forma opcional regiones en lámina plegada no beta;

e) modificar las posiciones de aminoácidos seleccionadas mediante sustitución, inserción, deleción y/o modificación química, conservando el motivo de plegamiento de tipo ubiquitina;

f) poner en contacto la proteína modificada con la pareja de unión determinado en la etapa b);

g) detectar aquellas proteínas que presentan una afinidad de unión, expresada en KD, por la pareja de unión predeterminada de 10-5 M a 10-12 M frente a la pareja de unión predeterminada en la etapa b), y que presentando modificaciones tales, que forman una región continua de 5 a 10 aminoácidos sobre la superficie de la proteína, en la que al menos se encuentran modificados cuatro aminoácidos expuestos en la superficie en la región en lámina plegada beta.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa e) se lleva a cabo mediante síntesis química de la proteína modificada.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la modificación en la etapa e) se realiza mediante modificación de ingeniería genética de un ADN perteneciente a la proteína modificada correspondiente, y la expresión de la proteína se realiza en organismos huésped procariotas o eucariotas o in vitro.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que en la etapa e) se genera una biblioteca génica.

5. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que en la etapa e) se lleva a cabo mediante mutagénesis aleatoria una sustitución aleatoria de los aminoácidos seleccionados.

6. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que en la etapa f) se realiza la puesta en contacto con la pareja de unión predeterminada mediante un procedimiento de selección adecuado, preferiblemente el procedimiento de presentación en fago, presentación en ribosoma, presentación en ARNm, presentación en CIS o presentación en superficie celular, presentación en superficie de levadura, presentación en superficie bacteriana, de forma particular preferiblemente mediante el procedimiento de presentación en fago.

7. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que en la etapa g) se realiza la detección de las proteínas con una afinidad de unión con la pareja de unión predeterminada mediante uno o varios de los siguientes procedimientos: ELISA, espectroscopía de resonancia de plasmón superficial, espectroscopía de fluorescencia, FACS, calorimetría de valoración isotérmica o ultracentrifugación analítica.

8. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que tras la etapa g) sigue una etapa de aislamiento y/o enriquecimiento de la proteína detectada con afinidad de unión con la pareja de unión predeterminada.

9. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína es madurada mediante procedimientos conocidos en lo que respecta a su afinidad de unión, su especificidad de unión y/o otras propiedades químico-proteicas, por ejemplo, estabilidad, solubilidad o rendimiento.

10. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína se une de forma dirigida de sitio y covalentemente con una proteína de igual o distinta especificidad, con lo que se obtiene una proteína bivalente o biespecífica.

11. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína humana es ubiquitina u otra ubiquitina de mamífero.

12. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que las modificaciones comprenden una región continua de 6 a 8 aminoácidos sobre la superficie de la proteína.

13. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que la primera y cuarta hebra en lámina plegada beta está modificada en sus aminoácidos expuestos en la superficie.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que de forma opcional adicionalmente en la ubiquitina de mamífero están modificadas las regiones de aminoácidos 62 a 65 de las regiones en lámina plegada no beta.

15. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que la modificación es una sustitución, inserción, deleción, modificación química o combinaciones de las mismas, y comprende uno o varios aminoácidos, preferiblemente una sustitución, al menos parcial de aminoácidos adyacentes o no directamente adyacentes en la secuencia primaria, en el que preferiblemente los aminoácidos modificados que no son adyacentes en la secuencia primaria forman en la estructura secundaria una región de unión preferiblemente continua para la pareja de unión.

16. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que el número de modificaciones, preferiblemente sustituciones, de aminoácidos directamente adyacentes en la secuencia primaria es de 2 a 8 aminoácidos directamente adyacentes, adicionalmente preferiblemente de 3 a 7 o de 4 a 6 o de 2 a 4 aminoácidos directamente adyacentes.

17. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que una parte de los aminoácidos modificados directamente adyacentes en la secuencia primaria se encuentra en una región de inicio o final de una hebra en lámina plegada beta, presentando esta parte una longitud de dos o más aminoácidos, preferiblemente de dos o tres aminoácidos.

18. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que están modificados 5 o más aminoácidos directamente adyacentes en la primaria secuencia, preferiblemente sustituidos, de los cuales uno, dos

o más, preferiblemente dos o tres, aminoácidos directamente adyacentes forman el comienzo o el final de una región de hebra en lámina plegada beta.

19. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que están modificados aminoácidos en aquellas posiciones que no pertenecen a regiones que son parte de una proteína natural según la reivindicación 1 en uniones con parejas de unión de ubiquitina naturales.

20. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos el 25% de los aminoácidos presentes en las hebras beta de la proteína, preferiblemente ubiquitina, están modificados.

21. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que se realiza una modificación de aminoácidos también en regiones bucle de la proteína.

22. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que se trata de ubiquitina humana o una proteína homóloga a esta, y en el que están modificados al menos 8 aminoácidos de la ubiquitina expuestos en la superficie, preferiblemente sustituidos, de modo que estos aminoácidos modificados comprenden la región con afinidad de unión con la pareja de unión.

23. Procedimiento según la reivindicación 22, en el que al menos seis de los ocho aminoácidos expuestos en la superficie se encuentran en una región de la proteína que está asignada a la región de lámina plegada beta.

24. Procedimiento según la reivindicación 22 o 23, en el que al menos 5 de los aminoácidos modificados, preferiblemente sustituidos, se encuentran adyacentes directamente entre sí en la secuencia primaria.

25. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que están modificados aminoácidos que se encuentran en la hebra en lámina plegada beta aminoterminal y/o en la hebra en lámina plegada beta carboxiterminal de la proteína.

26. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que están modificados adicionalmente aminoácidos que se encuentran en el bucle que sigue a la hebra en lámina plegada beta carboxiterminal.

27. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína modificada es ubiquitina humana que se sustituyó, delecionó, insertó y/o modificó químicamente, preferiblemente se sustituyó, en las posiciones 2, 4, 6, 62, 63, 64, 65 y 66.

28. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína que se selecciona para la modificación, ya presenta inserciones, deleciones, sustituciones y/o modificaciones químicas, de modo que se han suprimido o se han generado de nuevo funciones biológicas y/o químico-proteicas de la proteína.

29. Procedimiento según la reivindicación 28, en el que en la proteína se encuentran intercambiados tras la modificación en total al menos 10, preferiblemente al menos 15 aminoácidos de la ubiquitina.

30. Procedimiento según la reivindicación 28 ó 29, en el que la proteína que se selecciona para la modificación por sustitución, inserción y/o deleción es ubiquitina humana que está sustituida en una o varias de las siguientes posiciones: 44, 48, 54, 70, 72, 75, y en la que está delecionada la posición de aminoácido 76, de modo tal que la ubiquitina ya no presenta sustancialmente interacción con su pareja de unión natural.

31. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína es ubiquitina humana que contiene en la posición 45 la sustitución fenilalanina por triptófano.

32. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que la pareja de unión es un antígeno o un hapteno.

5 33. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que la afinidad de unión, expresada en KD, con la pareja de unión predeterminada es 10-6 M a 10-12 M, adicionalmente preferiblemente hasta 10-12 M o 10 9 a 10-12 M.

34. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que se obtienen proteínas para la

detección, para la determinación cuantitativa, para la separación y/o para el aislamiento de la pareja de unión 10 correspondiente por medio de procedimientos en sí conocidos, tales como técnicas de cromatografía o de adsorción.

35. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el que se obtienen proteínas para el diagnóstico, profilaxis y tratamiento de enfermedades, en el que toma parte la pareja de unión correspondiente directa o indirectamente.