Método para construir una biblioteca de secuenciación con base en una muestra de sangre y uso de la misma para determinar una anormalidad genética fetal.

Un método para preparar una biblioteca para la secuenciación usando una muestra de ADN de una muestra de sangre,

que comprende:

(a) aislar una muestra de ADN de la muestra de sangre,

(b) desfosforilación de la muestra de ADN para obtener un producto de fragmentación desfosforilado, y

(c) someter los fragmentos de ADN desfosforilados de dicho producto de fragmentación a las siguientes etapas para obtener una biblioteca de ADN cíclicos para secuenciación:

(i) reparación final para obtener un fragmento de ADN de cadena doble que tiene dos extremos romos con cuatro nucleótidos terminales que carecen cada uno de un grupo fosfato;

(ii) ligar un primer adaptador y un segundo adaptador que son diferentes entre sí con el fragmento de ADN de cadena doble respectivamente en los dos extremos romos en una reacción de una etapa para obtener un primer producto de ligación, siendo cada uno del primer adaptador y el segundo adaptador un oligonucleótido aislado que comprende: una primera cadena que tiene un grupo fosfato en el extremo 5' y un didesoxinucleótido en el extremo 3' y una segunda cadena que carece de un grupo fosfato en el extremo 5' y que tiene un didesoxinucleótido en el extremo 3', teniendo dicha primera cadena una longitud mayor que la de dicha segunda cadena y formando la primera y segunda cadena una estructura de cadena doble,

(iii) reemplazar la segunda cadena del primer adaptador con un primer ADN de cadena sencilla y reemplazar la segunda cadena del segundo adaptador con un segundo ADN de cadena sencilla, seguido por una reacción de traslado de muesca obteniendo así un segundo producto de ligación, estando el primer ADN de cadena sencilla adaptado para formar una estructura de cadena doble con la primera cadena del primer adaptador, y estando el segundo ADN de cadena sencilla adaptado para formar una estructura de cadena doble con la primera cadena del segundo adaptador,

(iv) amplificar el segundo producto de ligación usando un primer cebador y un segundo cebador para obtener un fragmento amplificado de ADN de doble cadena, en donde el primer cebador comprende una secuencia idéntica a uno de dicho primer ADN de cadena sencilla y dicho segundo ADN de cadena sencilla y el segundo cebador comprende una secuencia idéntica a la otra de dicho primer ADN de cadena sencilla y dicho segundo ADN de cadena sencilla y posee una biotina adicional;

(v) aislar un fragmento de ADN de cadena sencilla que contiene biotina de dicho ADN de cadena doble amplificado y

(vi) ciclar el fragmento aislado de ADN de cadena sencilla.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/CN2014/087589.

Solicitante: BGI Genomics Co., Limited.

Inventor/es: BALLINGER,DENNIS,G, CHEN,FANG, ZHANG,YANYAN, JIANG,HUI, GUO,YULAI, ZENG,PENG, XU,XUN, YANG,HUANMING, BASHKIROV,VLADIMIR I, SETHI,HIMANSHU.

Fecha de Publicación: 18 de Septiembre de 2018.

Clasificación Internacional de Patentes:

C12N15/10 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).
C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
C40B40/08 C […] › C40 TECNOLOGIA COMBINATORIA. › C40B QUIMICA COMBINATORIA; BIBLIOTECAS, p. ej. QUIMIOTECAS (bibliotecas combinatorias in silico de ácidos nucleicos, proteínas o péptidos G16B 35/00; química combinatoria in silico G16C 20/60). › C40B 40/00 Bibliotecas per se , p. ej. arrays, mezclas. › Bibliotecas que contienen ARN o ADN que codifican proteínas, p. ej. genotecas.
C40B50/06 C40B […] › C40B 50/00 Procedimientos de creación de bibliotecas, p. ej. síntesis combinatoria. › Procedimientos bioquímicos, p. ej. empleando enzimas o microorganismos enteros viables.

PDF original: ES-2682068_T3.pdf

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