BIBLIOTECA DEL DOMINIO KUNITZ.

Una biblioteca que comprende una pluralidad de partículas de fago filamentoso,

cada partícula de fago de la pluralidad incluyendo (i) una proteína de expresión que comprende un dominio Kunitz y al menos una porción de una proteína de recubrimiento de fago del gen III que se une físicamente a la partícula del fago y que se fusiona con el dominio Kunitz, (ii) un ácido nucleico que incluye (a) genes de fago suficientes para producir una partícula infecciosa de fago, dichos genes de fago comprendiendo un gen que codifica una proteína de recubrimiento de fago del gen III que está (i') no fusionada a una secuencia de aminoácidos no viral de al menos cinco aminoácidos o (ii') no fusionada a una secuencia modificada de aminoácidos y (b) una secuencia que codifica la proteína de expresión, en donde el dominio Kunitz incluye al menos una posición modificada de aminoácido en cada uno de los dos bucles de interacción, siendo modificadas las posiciones en los bucles respectivos entre las partículas de la pluralidad, y en donde el número promedio de copias del dominio Kunitz por partículas de fago de la pluralidad es menor a 2,0

Antecedentes

La metodología de expresión de fagos puede ser utilizada para identificar ligandos de proteína que interactúan con un objetivo particular. Esta técnica utiliza partículas de bacteriófago como vehículos para el enlazamiento de ligandos de proteína candidatos con los ácidos nucleicos que los codifican. El ácido nucleico codificador se empaca dentro del bacteriófago, y generalmente la proteína codificada sobre la superficie del fago. La metodología de expresión de fagos está descrita, por ejemplo, en Ladner et al., Patente Estadounidense No. 5.223.409; Smith (1985) Science 228: 1315 -1317; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem 274: 18218 -30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4: 1 -20; y en Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2: 371 -8. Otros métodos de evaluación de proteína, por ejemplo, arreglos de proteína, pueden ser utilizados también para identificar ligandos útiles.

Se pueden utilizar una variedad de armazones de proteína como molde para identificar ligandos útiles. Los armazones de proteína útiles pueden incluir posiciones de aminoácidos que contribuyen a una estructura estable del armazón de proteína y a otras posiciones que pueden variarse para producir un sitio de enlazamiento que interactúa con un objetivo.

Además, US 6 423 498 B1 se relaciona con una biblioteca variada de péptidos con el dominio Kunitz y con los usos del mismo.

También, Markland W et al. (Biochemistry 18 Jun 1996, vol. 35, no. 24) divulga la "optimización repetitiva de inhibidores de proteasas de alta afinidad utilizando expresión de fagos. 1. Plasmina".

Además, Clackson T y Wells J (Trends in Biotechnology, vol. 12, 1994, página 173) describe la "Selección in vitro de bibliotecas de péptido y de proteína".

Resumen

Se divulgan bibliotecas, vectores, partículas de fago, células huésped, y métodos para presentar un dominio Kunitz. Una biblioteca de ejemplo es una biblioteca de fagos que incluye partículas de fago que contienen suficientes genes de fago para producir partículas de fago y una proteína de expresión que tiene un dominio Kunitz modificado. Un domino Kunitz puede variar en al menos dos bucles de interacción con respecto a otros miembros de la biblioteca. En una modalidad, se pueden presentar dominios Kunitz modificados sobre un fago filamentoso en una valencia baja. En una modalidad, la valencia baja es proporcionada por un ácido nucleico de fago que incluye una secuencia que codifica la proteína de expresión fusionada a un dominio funcional de una proteína de recubrimiento menor y una secuencia que produce una proteína homóloga que también incluye el dominio funcional.

En un aspecto la invención se caracteriza por una biblioteca que incluye una pluralidad de partículas filamentosas de fago como se define en las reivindicaciones. Cada partícula de fago de la pluralidad incluye (i) una proteína de expresión que comprende un dominio Kunitz, (ii) un ácido nucleico que incluye (a) opcionalmente, genes de fago suficientes para producir una partícula infecciosa de fago y (b) una secuencia que codifica la proteína de expresión. El dominio Kunitz incluye al menos una posición variada de aminoácido en cada uno de los dos bucles de interacción. Las posiciones en los bucles respectivos se modifican entre las partículas de la pluralidad. El número promedio de copias del dominio Kunitz por partículas de fago de la pluralidad es menor a 2,0.

El dominio Kunitz puede ser al menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99, ó 100% idéntico a un dominio Kunitz humano (por ejemplo, LACI-K1) en posiciones de aminoácidos que no se modifican. En una modalidad, se modifican entre una y quince, por ejemplo, cinco y doce posiciones de aminoácidos entre las partículas de la pluralidad. Por ejemplo, se modifican al menos las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones de los

aminoácidos 16, 17, 18, 19, 34, y 39 de LACI-K1 humano entre las partículas de la pluralidad. En otro ejemplo, se modifican al menos las posiciones de los aminoácidos correspondientes a las posiciones de los aminoácidos 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 34, y 39 de LACI-K1 humano entre las partículas de la pluralidad. En aún otro ejemplo, se modifican al menos seis, siete u ocho posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones de los aminoácidos 11, 13, 15, 16,17, 18,19, 32, 34, 39, 40, y 46 de LACI-K1 humano entre las partículas de la pluralidad. Únicamente se pueden variar Las posiciones de los aminoácidos correspondientes a las posiciones de los aminoácidos 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 34, 39, y 40 de LACI-K1 humano entre las partículas de la pluralidad, o únicamente 16, 17, 18, 19, 34, y 39, o únicamente 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 34, y 39, u otras combinaciones.

Cada dominio Kunitz en la pluralidad puede incluir al menos 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99, ó 100% de los dominios Kunitz en la pluralidad puede incluir residuos Kunitz conservados o residuos Kunitz altamente conservados en algunas (por ejemplo, 50, 60, 80, ó 90%) o en todas las posiciones modificadas. Cada dominio Kunitz en la pluralidad puede incluir al menos 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99, ó 100% de los dominios Kunitz en la pluralidad puede incluir residuos Kunitz conservados o residuos Kunitz altamente conservados en algunas (por ejemplo, 50, 60, 80, ó 90%) o en todas las posiciones que no varían. En una modalidad, los aminoácidos en las posiciones 32 y 46 no varían.

El grado de variaciones puede diferir en diferentes posiciones modificadas. Por ejemplo, las posiciones de los aminoácidos correspondientes a la posición del aminoácido 40 pueden ser modificadas entre G y A. Si no se modifica la posición 40, entonces puede ser restringida a G o A, por ejemplo. Se pueden modificar otras posiciones cambiadas, en formas diversas, entre todos los aminoácidos, todos los aminoácidos que no son cisteína, todos los aminoácidos excepto C y P, todos los aminoácidos excepto C, P y G, hidrófobos, alifáticos, hidrofílicos, y cargados.

En una modalidad, la proteína de expresión incluye un dominio funcional de una proteína menor de recubrimiento fusionada al dominio Kunitz, y los genes del fago incluyen un gen que codifica la proteína menor de recubrimiento que está (i') no fusionada a una secuencia de aminoácidos no viral de al menos cinco aminoácidos o (ii') no fusionada a una secuencia modificada de aminoácidos. Por ejemplo, los genes del fago pueden incluir una copia de tipo silvestre del gen que codifica la proteína menor endógena de recubrimiento del bacteriófago. Generalmente, los genes del fago pueden ser copias de tipo silvestre o variantes funcionales de los mismos.

Además de la pluralidad de partículas de fago caracterizadas anteriormente, pueden estar presentes otras partículas de fago, incluyendo por ejemplo, partículas inactivas que carecen de un componente de ácido nucleico.

En otro aspecto, se describe una biblioteca que incluye una pluralidad de partículas de fago. Cada partícula de fago de la pluralidad incluye (i) una proteína de expresión que contiene un dominio Kunitz y al menos una porción de la proteína de recubrimiento de fago del gen III, (II) una proteína funcional de recubrimiento de fago del gen III, y (iii) un ácido nucleico que incluye (a) opcionalmente, genes de fago suficientes para producir una partícula infecciosa de fago y (b) una secuencia que codifica la proteína de expresión. El dominio Kunitz puede incluir una secuencia que sea al menos 50, 60, 70, 80, 85, 87, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 100% idéntica a MHSFCAFKADX11GX13CX15X16X17X16X19RFFFNIFTRQCEEFX34YGGCX39X40 QNRFESLEECKKMCTRDGA, en posiciones a parte de X (SEQ ID NO: 10). Por ejemplo, X11 es unode: A,D, E, F,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V,W,Y; X13 es unode: A,D, E, F,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V,W,Y; X15 es unode: A,D, E, F,G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V,W, Y; X16 es unode: A,G, E, D, H, T; X17 es unode: A,D, E, F,G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V,W, Y; X18 es unode: A,D, E, F,G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V,W, Y; X19 es unode: A,D, E, F,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V,W,Y; X34 es unode: A,C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V,W,Y; X39 es unode: A,C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V,W,Y; y X40 es uno de: G, A.

Al menos dos de X11, X13, X15, X16, X17, X18, X19, X34, X39, y X40 pueden variar entre partículas de la pluralidad. Al menos dos de las posiciones modificadas están típicamente... [Seguir leyendo]

1. Una biblioteca que comprende una pluralidad de partículas de fago filamentoso, cada partícula de fago de la pluralidad incluyendo (i) una proteína de expresión que comprende un dominio Kunitz y al menos una porción de una proteína de recubrimiento de fago del gen III que se une físicamente a la partícula del fago y que se fusiona con el dominio Kunitz, (ii) un ácido nucleico que incluye (a) genes de fago suficientes para producir una partícula infecciosa de fago, dichos genes de fago comprendiendo un gen que codifica una proteína de recubrimiento de fago del gen III que está (i') no fusionada a una secuencia de aminoácidos no viral de al menos cinco aminoácidos o (ii') no fusionada a una secuencia modificada de aminoácidos y (b) una secuencia que codifica la proteína de expresión, en donde el dominio Kunitz incluye al menos una posición modificada de aminoácido en cada uno de los dos bucles de interacción, siendo modificadas las posiciones en los bucles respectivos entre las partículas de la pluralidad, y en donde el número promedio de copias del dominio Kunitz por partículas de fago de la pluralidad es menor a 2,0.

2. La biblioteca de la reivindicación 1 en donde el dominio Kunitz el al menos 85% idéntico a un dominio Kunitz humano en las posiciones de los aminoácidos que no se modifican.

3. La biblioteca de la reivindicación 1 en donde dicho dominio Kunitz comprende entre 5 y 12 posiciones modificadas de aminoácidos entre las partículas de la pluralidad.

4. La biblioteca de la reivindicación 3 en donde dichas posiciones modificadas de los aminoácidos incluyen posiciones de los aminoácidos correspondientes a las posiciones de los aminoácidos 16, 17, 18, 19, 34, y 39 de LACI-K1 humana.

5. La biblioteca de la reivindicación 4 en donde dichas posiciones modificadas de los aminoácidos incluyen posiciones de los aminoácidos 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 34, y 39 de LACI-K1 humana.

6. La biblioteca de la reivindicación 3 en donde dichas posiciones modificadas de los aminoácidos consisten de las posiciones de los aminoácidos correspondientes a las posiciones de los aminoácidos 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 34, 39 y 40 de LACI-K1 humana.

7. La biblioteca de la reivindicación 1 en donde la posición del aminoácido correspondiente a la posición del aminoácido 40 es G o A, o está modificada entre G y A.

8. La biblioteca de la reivindicación 1, en donde el dominio Kunitz comprende una secuencia que es al menos 85% idéntica a MHSFCAFKADX11GX13CX15X16X17X18X19RFFFNIFTRQCEEFX34YGGCX39X40N QNRFESLEECKKMCTRDGA (SEQ ID NO: 10), en posiciones diferentes a X; y el dominio Kunitz difiere de la secuencia de LACI-K1 en al menos un residuo aminoácido; y X11 es unode: A,D, E, F,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V,W,Y; X13 es unode: A,D, E, F,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V,W,Y; X15 es unode: A,D, E, F,G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V,W, Y; X16 es unode: A,G, E, D, H, T; X17 es unode: A,D, E, F,G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V,W, Y; X18 es unode: A,D, E, F,G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V,W, Y; X19 es unode: A,D, E, F,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V,W,Y; X34 es unode: A,C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V,W,Y; X39 es unode: A,C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V,W,Y; y X40 es unode: G, A,y en donde al menos dos de X11, X13, X15, X16, X17, X18, X19, X34, X39, y X40 varían entre partículas de la pluralidad, estando al menos dos de las posiciones modificadas en el primero y en el segundo bucles de interacción del dominio Kunitz.

9. La biblioteca de la reivindicación 8 en donde la proteína de expresión incluye al muñón de la proteína de recubrimiento del gen III.

10. La biblioteca de la reivindicación 8 en donde los genes del fago incluyen un gen que codifica una proteína de recubrimiento del gen III de tipo silvestre.

11. La biblioteca de la reivindicación 8 en donde la biblioteca tiene una diversidad teórica entre 103 y 1012 .

12. La biblioteca de la reivindicación 11 en donde al menos las posiciones de los aminoácidos 15, 16, 17, 18, 34 y 39 son modificadas.

13. La biblioteca de la reivindicación 11 en donde las posiciones de los aminoácidos 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 34, 39 y 40 son modificadas.

14. La biblioteca de la reivindicación 8 en donde el número promedio de copias del dominio Kunitz por partículas de fago de la pluralidad es menor a 1.5.

15. La biblioteca de la reivindicación 1 en donde el dominio Kunitz es al menos 85% idéntico a LACI-K1 humana en las posiciones de los aminoácidos que no son modificadas.

16. La biblioteca de la reivindicación 1 en donde el dominio Kunitz es idéntico a LACI-K1 humana en las posiciones de los aminoácidos que no son modificadas.

17. La biblioteca de la reivindicación 8 en donde el dominio Kunitz incluye una secuencia que es 100% idéntica a MHSFCAFKADX11GX13CX15X16X17X18X19RFFFNIFTRQCEEFX34YGGCX39X40N QNRFESLEECKKMCTRDGA (SEQ ID NO: 10), en posiciones diferentes a X.

18. La biblioteca de la reivindicación 8, cada partícula fago de la pluralidad incluye adicionalmente

(iii) una proteína de recubrimiento de fago del gen III funcional, particularmente en donde la biblioteca está definida adicionalmente como en cualquiera de las reivindicaciones 9 14 ó 17.

19. Un método para proporcionar un ácido nucleico que codifica un dominio Kunitz que interactúa con un objetivo, comprendiendo el método: proporcionar la biblioteca de la reivindicación 1; poner en contacto las partículas de fago de la biblioteca con un objetivo; y recuperar el ácido nucleico de las partículas que interactúan con el objetivo.

20. El método de la reivindicación 19 en donde el objetivo está inmovilizado, y la etapa de recuperación comprende la separación de las partículas que interactúan con el objetivo de las partículas que no interactúan con el objetivo.

21. Un método para proporcionar ácido nucleico que codifica un dominio Kunitz que interactúa con un objetivo, comprendiendo el método: proporcionar la biblioteca de la reivindicación 8 ó 18; poner en contacto las partículas de fago de la biblioteca con un objetivo; y recuperar el ácido nucleico de las partículas que interactúan con el objetivo.

22. El método de la reivindicación 21 en donde el objetivo es una proteasa.

23. Un vector fago que comprende:

(a) genes de fago suficientes para producir una partícula infecciosa de fago y (b) una secuencia que codifica una proteína de expresión comprendiendo la proteína de expresión un dominio Kunitz y al menos una porción de una proteína de recubrimiento de fago del gen III que se une físicamente a la partícula de fago y que se fusiona al dominio Kunitz, comprendiendo el dominio Kunitz una secuencia que es al menos 85% idéntica a MHSFCAFKADX11GX13CX15X16X17X18X19RFFFNIFTRQCEEFX34YGGCX39X40N QNRFESLEECKKMCTRDGA (SEQ ID NO: 10), en posiciones diferentes a X; X11 es unode: A,D, E, F,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V,W,Y;

X13 es unode: A,D, E, F,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V,W,Y;

X15 es unode: A,D, E, F,G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V,W, Y;

X16 es unode: A,G, E, D, H, T;

X17 es unode: A,D, E, F,G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V,W, Y;

5 X18 es unode: A,D, E, F,G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V,W, Y;

X19 es unode: A,D, E, F,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V,W,Y;

X34 es unode: A,C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V,W,Y;

X39 es unode: A,C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V,W,Y; y

X40 es uno de: G, A, en donde los genes de fago incluyen un gen que codifica a la proteína de recubrimiento de fago 10 del gen III que no está fusionada a una secuencia heteróloga que codifica más de cinco aminoácidos.