GENERACIÓN DE ELEMENTOS DE UNIÓN ESPECÍFICA QUE SE UNEN A (POLI)PÉPTIDOS CODIFICADOS POR FRAGMENTOS DE ADN GENÓMICO O EST.

Un procedimiento para generar un elemento de unión específica a un (poli)péptido que está codificado por una secuencia de ácido nucleico comprendida en un fragmento de ADN genómico o un marcador de secuencia expresada (EST) que comprende:

a) expresar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión en una célula hospedadora en condiciones que permitan la formación de cuerpos de inclusión que comprenden dicha proteína de fusión, en el que dicha proteína de fusión comprende aa) un elemento de fusión de (poli)péptido/proteína que se deposita en cuerpos de inclusión cuando se expresa en dicha célula hospedadora en dichas condiciones y que comprende el primer dominio N-terminal de la proteína del gen III de fago filamentoso y ab) dicho (poli)péptido, en el que dicha célula hospedadora es E. coli; b) aislar dichos cuerpos de inclusión; y c) generar una inmunoglobulina o un fragmento de la misma que se une específicamente a dicho (poli)péptido seleccionando un miembro de una colección recombinante de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas expuesto en la superficie de un fago filamentoso que comprende el primer dominio N-terminal de la proteína del gen III, en el que la proteína del gen III se expone en la superficie de dicho fago filamentoso

La presente invención se refiere a la generación de elementos de unión específica que se unen a (poli)péptidos codificados por fragmentos de ADN genómico o EST. Los (poli)péptidos se expresan como parte de proteínas de fusión que forman cuerpos de inclusión en la expresión en células hospedadoras. Los cuerpos de inclusión se usan para generar elementos de unión que se unen específicamente a dichos (poli)péptidos. Los elementos de unión específica, en particular inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas, son útiles para el análisis y la caracterización funcional de proteínas codificadas por secuencias de ácido nucleico que comprenden los correspondientes fragmentos de ADN genómico o EST. La invención se refiere adicionalmente a moléculas de ácido nucleico, vectores y células hospedadoras para usar en los procedimientos de la presente invención.

La invención se refiere adicionalmente al uso de proteínas de fusión que comprenden el primer dominio N-terminal de la proteína del gen III de fago filamentoso como elemento de fusión para la expresión de un (poli)péptido/proteína fusionado con dicho elemento de fusión, y a procedimientos para la expresión de (poli)péptidos/proteínas.

Desde hace varios años, se están realizando grandes esfuerzos por secuenciar el genoma humano, y por identificar y caracterizar la estructura y función de las proteínas codificadas en el mismo. Finalmente, esto conducirá a dianas novedosas para la prevención, diagnóstico y terapia de enfermedades. (Collins y Galas, 1993; Adams y col., 1995).

Actualmente, se están siguiendo dos enfoques diferentes para identificar y caracterizar los genes distribuidos a lo largo del genoma humano. En un enfoque, se aíslan, clonan y secuencian fragmentos grandes de ADN genómico. Se identifican los marcos abiertos de lectura potenciales en estas secuencias genómicas usando software bioinformático. Sin embargo, este enfoque implica secuenciar grandes tramos de ADN humano que no codifican proteínas para encontrar las secuencias de codificación de proteínas dispersadas a lo largo del genoma. Además de requerir una extensa secuenciación, el software bioinformático puede caracterizar erróneamente las secuencias genómicas obtenidas. Por tanto, el software puede producir falsos positivos en los que el ADN no codificante se caracteriza erróneamente como ADN codificante, o falsos negativos en que el ADN codificante se marca erróneamente como ADN no codificante.

En un enfoque alternativo, se sintetizan ADN complementarios (ADNc) a partir de ARN mensajeros aislados (ARNm) que codifican proteínas humanas. Usando este enfoque, la secuenciación se efectúa solo en ADN que deriva de secuencias de codificación de proteína del genoma. A menudo, se secuencian solo tramos cortos de los ADNc para obtener secuencias denominadas marcadores de secuencia expresada (EST) (documento

WO93/00353).

En principio, los EST pueden usarse entonces para aislar o purificar ADNc extendidos que incluyen secuencias adyacentes a las secuencias de EST. Estos ADNc extendidos pueden contener porciones o la secuencia de codificación completa del gen del que derivaba el EST.

Al analizar el ADN genómico o fragmentos del mismo, EST, ADNc extendidos y/o los (poli)péptidos/proteínas codificados por los mismos, en ciertos casos en que puede identificarse la homología, motivos estructurales, etc., puede ser posible asignar una función al (poli)péptido proteína que puede ensayarse o verificarse in vitro o in vivo. Sin embargo, los diversos esfuerzos de secuenciación de EST han conducido a números enormes de EST, y al problema de cómo estructurar esa información y cómo identificar las secuencias interesantes. Por tanto, sigue habiendo la necesidad de desarrollar y usar herramientas de investigación dirigidas al (poli)péptido/proteína de interés para analizar su localización en la célula y los tipos de tejido, su regulación positiva o negativa en ciertas enfermedades o etapas de desarrollo o su papel en la activación o el bloqueo de ciertas interacciones o rutas de señalización.

Es un enfoque usar anticuerpos o fragmentos de los mismos como dichas herramientas de investigación. En el documento WO93/00353, se sugería expresar los EST y generar anticuerpos inmunizando animales con los correspondientes (poli)péptidos. En un enfoque similar, se han inyectado constructos de ADN que comprenden secuencias de EST en animales para generar una respuesta inmunitaria frente al (poli)péptido expresado in vivo (Sykes y Johnston, 1999). Sin embargo, estos enfoques no son factibles para una generación de anticuerpos de alto rendimiento.

Como alternativa, se generan anticuerpos contra series de péptidos superpuestos que cubren la secuencia de EST (Persic y col., 1999). En combinación con el cribado de colecciones de anticuerpos recombinantes, este enfoque puede desarrollarse en principio para generar fragmentos de anticuerpo como herramientas de investigación de alto rendimiento. Sin embargo, a menudo es difícil obtener anticuerpos anti-péptido con afinidades suficientemente altas.

Por tanto, el problema técnico subyacente de la presente invención es proporcionar un procedimiento aplicable en general para la generación de elementos de unión específica que se unan a (poli)péptidos codificados por fragmentos de ADN genómico o por EST, especialmente de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, para el análisis y la caracterización funcional de las proteínas correspondientes al ADN genómico o EST. Se consigue la solución al problema técnico anterior proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. El enfoque técnico de la presente invención, proporcionar (poli)péptidos codificados por fragmentos de ADN genómico o EST para la generación de elementos de unión específica, tales como anticuerpos o productos derivados de anticuerpo, expresando los (poli)péptidos como fusiones con elementos de fusión de (poli)péptido/proteína que conducen a la formación de cuerpos de inclusión en la expresión en células hospedadoras tales como E. coli, y a generar elementos de unión específica frente a los cuerpos de inclusión y proteínas de fusión obtenidas a partir de los mismos, ni se proporciona ni se sugiere por la técnica anterior.

Un problema adicional relacionado con la presente invención era idear un procedimiento para la expresión de (poli)péptidos/proteínas que no se expresen fácilmente en forma libre, por ejemplo, porque son tóxicos para la célula hospedadora. La solución a ese problema técnico se consigue también proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. El enfoque técnico de la presente invención, expresar (poli)péptidos/proteínas como proteínas de fusión que comprenden el primer dominio N-terminal de la proteína del gen III de fago filamentoso, conduciendo a la formación de cuerpos de exclusión, no se proporciona ni sugiere por la técnica anterior.

Por tanto, la presente invención se refiere a un procedimiento para generar un elemento de unión específica a un (poli)péptido que está codificado por una secuencia de ácido nucleico comprendida en un fragmento de ADN genómico o un marcador de secuencia expresada (EST) que comprende:

a) expresar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión en una célula hospedadora en condiciones que permitan la formación de cuerpos de inclusión que comprenden dicha proteína de fusión, en el que dicha proteína de fusión comprende

aa) un elemento de fusión de (poli)péptido/proteína que se deposita en

cuerpos de inclusión cuando se expresa en dicha célula hospedadora en

dichas condiciones y que comprende el primer dominio N-terminal de la

proteína del gen III de fago filamentoso y

ab) dicho (poli)péptido;

b) aislar dichos cuerpos de inclusión; y

c) generar un elemento de unión específica que se une específicamente a dicho (poli)péptido, seleccionando un miembro de una colección recombinante de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas expuesto en la superficie de un fago filamentoso, que comprende el primer dominio N-terminal de la proteína del gen III, en el que la proteína del gen III se expone en la superficie de dicho fago filamentoso.

En el contexto de la presente invención, un “elemento de unión específica” es una molécula que es capaz de unirse específicamente a un (poli)péptido de interés. Dicho elemento de unión específica...

1. Un procedimiento para generar un elemento de unión específica a un (poli)péptido que está codificado por una secuencia de ácido nucleico comprendida en un fragmento de ADN genómico o un marcador de secuencia expresada (EST) que comprende:

a) expresar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión en una célula hospedadora en condiciones que permitan la formación de cuerpos de inclusión que comprenden dicha proteína de fusión, en el que dicha proteína de fusión comprende

aa) un elemento de fusión de (poli)péptido/proteína que se deposita en cuerpos de inclusión cuando se expresa en dicha célula hospedadora en dichas condiciones y que comprende el primer dominio N-terminal de la proteína del gen III de fago filamentoso y

ab) dicho (poli)péptido, en el que dicha célula hospedadora es E. coli; b) aislar dichos cuerpos de inclusión; y c) generar una inmunoglobulina o un fragmento de la misma que se une

específicamente a dicho (poli)péptido seleccionando un miembro de una colección recombinante de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas expuesto en la superficie de un fago filamentoso que comprende el primer dominio N-terminal de la proteína del gen III, en el que la proteína del gen III se expone en la superficie de dicho fago filamentoso.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha proteína de fusión comprende dicho elemento de fusión como porción N-terminal y dicho (poli)péptido como porción C-terminal.

3. El procedimiento de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicha proteína de fusión comprende un ligante (poli)peptídico que liga dicho elemento de fusión y dicho (poli)péptido.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicho ligante comprende una señal de escisión.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho fragmento de ADN genómico o dicho EST se obtiene a partir de un organismo procariótico o de un virus.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho organismo procariótico o virus es un patógeno.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho fragmento de ADN genómico o dicho EST se obtiene a partir de un organismo eucariótico.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicho fragmento de ADN o EST se obtiene a partir de una especie no de mamífero.

9. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicho fragmento de ADN genómico o EST se obtiene a partir de una especie de mamífero.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha especie de mamífero es humana.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho ácido nucleico se expresa en condiciones que permiten la sobreexpresión de dicha proteína de fusión.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha proteína de fusión se expresa en el citosol.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho elemento de fusión consiste en los aminoácidos 1 a 82 de la proteína del gen III.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho fragmento de ADN genómico o EST es de entre 100 y 2.000 pares de bases de longitud.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho fragmento de ADN genómico o EST comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un (poli)péptido o consiste en un presunto marco abierto de lectura.

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa (b) comprende adicionalmente la etapa de (i) solubilizar dicha proteína de fusión en condiciones adecuadas.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que la etapa (b) comprende adicionalmente la etapa de (ii) replegar dicha proteína de fusión en condiciones adecuadas.

18. El procedimiento de la reivindicación 16 o 17, que comprende adicionalmente la etapa de purificar dicha proteína de fusión en forma libre.

19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho fragmento de inmunoglobulina es Fv, scFv, Fv ligado por disulfuro, Fab o (Fab')2.