PROTEINA QUIMERICA ALDOLASA/QUINASA, PROCEDIMIENTO DE OBTENCION Y SUSAPLICACIONES.

Proteína quimérica aldolasa/quinasa, procedimiento de obtención y sus aplicaciones.

La presente invención describe una nueva proteína quimérica que reúne en una única cadena polipeptídica dos actividades enzimáticas: una aldolasa y una quinasa, útil en la formación de enlaces C-C entre una cetona donadora y un aldehído aceptor complementándose el sistema con la regeneración in situ del ATP. Así, esta proteína quimérica permite desarrollar nuevos compuestos químicos con actividad biológica, por ejemplo, carbohidratos y análogos

Proteína quimérica aldolasa/quinasa, procedimiento de obtención y sus aplicaciones.

Campo técnico de la invención

La presente invención se enmarca en los sectores Químico y Farmacéutico, más concretamente en el campo de los biocatalizadores para la formación estereoselectiva de enlaces C-C, originando carbohidratos y análogos.

Estado de la técnica

El aumento en la demanda de fármacos enantioméricamente puros por parte de la industria farmacéutica ha disparado la investigación en síntesis asimétrica en condiciones de regio- y estereoquímica controladas.

Es particularmente interesante en el caso de estructuras polihidroxiladas como los hidratos de carbono, donde la actividad biológica de los compuestos originados a partir de ellos, depende de la estereoquímica de la molécula. Además, estrategias de síntesis química clásica pueden resultar muy tediosas al necesitar múltiples pasos de protección-desprotección que disminuyen los rendimientos de las reacciones y, muchas veces, dan lugar a mezclas de productos difíciles de purificar.

Así, los métodos enzimáticos de síntesis de hidratos de carbono han despertado gran interés en las últimas décadas ya que permiten un gran control de la regio- y estereoquímica de los productos, porque usan condiciones de reacción suaves y eliminan los pasos de protección-desprotección aumentando así los rendimientos.

Las aldolasas son enzimas que catalizan la formación de enlaces C-C mediante una reacción aldólica entre una cetona y un aldehído. De entre éstas destacan por su interés sintético las aldolasas dependientes de dihidroxiacetona fosfato (DHAP). Este grupo está formado por cuatro enzimas -fructosa 1,6-bisfosfato aldolasa, tagatosa 1,6-bisfosfato aldolasa, fuculosa 1-fosfato aldolasa y rhamnulosa 1-fosfato aldolasa- que catalizan la adición aldólica de la dihidroxiacetona fosfato con un aldehído aceptor generando 2 nuevos estereocentros cuya estereoquímica viene determinada por la enzima y no por los sustratos. Otra característica importante de estas enzimas es que cada una de ellas da lugar a un producto cuya estereoquímica en los carbonos 3 y 4 es complementaria de los otros productos (Figura 1); es decir, la utilización de estas permite obtener los cuatro diastereoisomeros a partir de un amplio número de aldehídos naturales y no naturales (García-Junceda, E., García-García, J. F., Bastida, A., Fernández-Mayoralas, A., 2004. Bioorg. Med. Chem., 12, 1817-1834). Las aldolasas dependientes de DHAP han demostrado su utilidad en la síntesis de carbohidratos, análogos de carbohidratos y otros compuestos no relacionados con éstos (Machajewski, T. D., Wong, C.-H., 2000. Angew. Chem. Int. Ed., 39, 1352-1375; Fessner, W.-D., Helaine, V., 2001. Curr. Opin. Biotechnol., 12, 574-586).

El principal inconveniente que presenta el uso en síntesis orgánica a nivel industrial de las enzimas aldolasas dependientes de dihidroxiacetona fosfato, es la disponibilidad de este compuesto (DHAP). Por un lado, la DHAP es lábil a pHs neutros o básicos, siendo éste el rango óptimo para las aldolasas implicadas en la formación de enlaces C-C, lo que provoca la disminución de la concentración de la DHAP por degradación durante el desarrollo de la reacción aldólica y, por otro lado, el precio de mercado de la DHAP es excesivamente caro para poder ser utilizada a nivel industrial.

Para intentar solventar la falta de disponibilidad de la DHAP han sido descritos diversos métodos de síntesis química y enzimática. Dentro de los métodos químicos se encuentran aquellos que parten de un dímero de dihidroxiacetona (DHA) (Jung, S. H., Jeong, J.-H., Miller, P., Wong, C.-H., 1994. J. Org. Chem., 59, 7182-7184; Charmantray, F., El Blidi, L., Gefflaut, T., Hecquet, L., Bolte, J., Lemaire, M., 2004. J. Org. Chem., 69, 9310-9312), o de la 1,3-dibromoacetona dando un precursor estable de la DHAP (Gefflaut, T., Lemaire, M., Valentín, M.-L., Bolte, J., J. Org. Chem., 1997, 62, 5920-5922). El principal inconveniente de estos métodos es que suelen tener costes muy elevados y/o bajos rendimientos que no suelen superan el 65%.

Otros métodos químicos alternativos para superar la dependencia de las aldolasas a la DHAP, son la formación in situ de ésteres de arsenato o vanadato de la DHA que actúan como miméticos del éster fosfato (D. G. Drueckhammer, J. R. Durrwachter, R. L. Pederson, D. C. Crans, L. Daniels, C.-H. Wong, J. Org. Chem. 1989, 54, 70-77; R. Schoevaart, F. van Rantwijk, R. A. Sheldon, J. Org. Chem. 2001, 66, 4559-4562; D. C. Crans, K. Sudhakar, T. J. Zamborelli, Biochemistry. 1992, 31, 6812-6821). En el uso de estos compuestos también se han detectado las siguientes objeciones: Aunque el arsenato ha sido utilizado eficazmente con propósitos sintéticos, su alta toxicidad impide su aplicación práctica. El vanadato también se ha utilizado incluso a menores concentraciones que el arsenato, pero el vanadato tiene una actividad redox que puede interferir con la reacción aldólica siendo también su alto precio, un factor importante a tener en cuenta en su utilización práctica.

Recientemente se ha reportado que en tampones de borato la DHA puede formar reversiblemente un éster borato que puede ser utilizado como sustrato por la rhamnulosa 1-fosfato aldolasa (M. Sugiyama, Z. Hong, L. J. Whalen, W. A. Greenberg, C.-H. Wong, Adv. Synth. Catal. 2006, 348, 2555-2559).

Por otra parte, la preparación enzimática de DHAP se lleva a cabo usualmente acoplada a la reacción catalizada por la aldolasa. Así, la DHAP puede ser preparada a partir de la oxidación del L-glicerol 3-fosfato (L-G3P) catalizada por la glicerofosfato oxidasa, junto con la descomposición del peróxido de hidrógeno mediada por la catalasa (Fessner, W.-D., Sinerius, G., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33, 209-212; United States Patent 5683897). Posteriormente, este sistema de preparación de DHAP ha sido acoplado con la preparación in situ del D,L-G3P bien mediante fosforilación del glicerol con la fosfatasa fitasa (Schoevaart, R., van Rantwijk, F., Sheldon, R. A., 2000. J. Org. Chem., 65, 6940-6943), o mediante apertura regioselectiva del epóxido rac-glicidol con fosfato (Charmantray, F., Dellis, P., Samreth, S., Hecquet, L., 2006. Tetrahedron Lett., 47, 3261-3263).

Otras estrategias descritas hasta el momento para la obtención de DHAP enzimáticamente son:

- la fosforilación de la DHA mediante la glicerol quinasa utilizando ATP como donador de grupos fosfato (Wong, C.- H., Whitesides, G. M., 1983. J. Org. Chem., 48, 3199-3205).

- la utilización de la isoenzima I de la enzima dihidroxiacetona quinasa (DHAK) procedente de la levadura Schizosaccharomyces pombe IFO 0354 como biocatalizador para la producción de DHAP con la regeneración in situ del ATP mediante un sistema basado en la utilización de la acetato quinasa (Itoh, N., Tujibata, Y., Liu, J. Q., 1999. Appl. Microbiol. Biotechnol., 51, 193-200).

- la fosforilación de la DHA catalizada por la fosfatasa ácida de Shigella flexneri utilizando pirofosfato como donador y su utilización acoplada a la reacción catalizada por la aldolasa (Van Herk, T., Hartog, A. F., Schoemaker, H. E., Wever, R., 2006. J. Org. Chem., 71, 6244-6247).

Además, los inventores de la presente invención desarrollaron un sistema multienzimático en el que, partiendo de DHA se obtiene DHAP mediante la fosforilación catalizada por la dihidroxiacetona quinasa (DHAK) de Citrobacter freundii CECT 4626 con consumo de ATP; la reacción aldólica se acopla a la generación in situ de la DHAP y el sistema se completa con la regeneración del ATP usando acetilfosfato como donador de fosfato y acetato quinasa (Sánchez-Moreno, I., García-García, J. F., Bastida, A., García-Junceda, E., 2004, Chem. Commun., 1634-1635). Este sistema de generación in situ de DHAP ya ha sido optimizado para la reacción acoplada con tres aldolasas dependientes de DHAP de utilidad sintética, mostrando su aplicabilidad con un amplio rango de aldehídos. Este sistema permite la formación de enlaces C-C catalizada por aldolasas dependientes de DHAP a partir de la DHA, que es un compuesto de bajo coste y alta estabilidad. El ATP es utilizado en concentraciones catalíticas para cebar el sistema. La DHAK de Citrobacter freundii CECT 4626 tiene una eficiencia catalítica hacia la DHA muy superior a otros biocatalizadores empleados en la fosforilación enzimática de DHA. Además, la DHAP es producida en condiciones no oxidantes que podrían disminuir la estabilidad del aldehído... [Seguir leyendo]

1. Proteína quimérica útil para la formación de enlaces C-C caracterizado porque comprende, al menos:

i) una secuencia de aminoácidos de una dihidroxiacetona quinasa,

ii) una secuencia de aminoácidos de una aldolasa monomérica, preferentemente de Staphylococcus carnosus, y

iii) una secuencia conectora L de las secuencias de aminoácidos de i) y ii).

2. Proteína quimérica según la reivindicación 1 caracterizada porque la secuencia de aminoácidos codificante de la aldolasa es la de la fructosa 1,6-bifosfato aldolasa monomérica de la bacteria Staphylococcus carnosus o de un fragmento de dicha secuencia, o una secuencia de aminoácidos análoga, o una secuencia de aminoácidos que codifica para una variante, natural o artificial o de un fragmento de la misma.

3. Proteína quimérica según las reivindicación 1 caracterizada porque la secuencia de aminoácidos codificante de la dihidroxiacetona quinasa es la de la dihidroxiacetona quinasa de la bacteria Citrobacter freundii cepa CECT 4626 o procedente de cualquier microorganismo, o de un fragmento de dicha secuencia, o una secuencia de aminoácidos análoga, o una secuencia de aminoácidos que codifica para una variante, natural o artificial o de un fragmento de la misma.

4. Proteína quimérica según las reivindicación 1 caracterizada porque la secuencia conectora L de aminoácidos entre las secuencias de la fructosa 1,6-bifosfato aldolasa monomérica y dihidroxiacetona quinasa, es la secuencia Gln-Gly-Gln-Gly-Gln.

5. Proteína quimérica según la reivindicación 1 caracterizada por presentar la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2.

6. Procedimiento de obtención de la proteína quimérica según las reivindicaciones 1 a la 5, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

- diseño de oligonucleótidos específicos conteniendo una secuencia conectora, preferentemente la secuencia Gln-Gly-Gln-Gly-Gln,

- amplificación por PCR por separado del gen dhak, dihidroxiacetona quinasa, de Citrobacter freundii CECT 4626 y de un gen de un enzima con actividad fructosa 1-6 bisfosfato aldolasa, preferentemente, el gen fda de Staphylococcus carnosus,

- introducción en los extremos 3' de la quinasa y 5' de la aldolasa de la secuencia conectora, preferentemente la secuencia Gln-Gly-Gln-Gly-Gln, y purificación de los fragmentos,

- amplificación por PCR de la secuencia de nucleótidos del Proteína quimérica de la invención, preferentemente la construcción DHAK-L-FDA, SEQ ID NO:1,

- introducción de la secuencia de nucleótidos del Proteína quimérica en un vector de expresión, transformación de una célula, ya sea eucariota o procariota, y producción y purificación de la proteína resultante, preferentemente la proteína de SEQ ID NO:2.

7. Secuencia de nucleótidos codificante de la proteína quimérica según las reivindicaciones 1 a la 5 caracterizada porque comprende:

i) una secuencia de nucleótidos codificante de una dihidroxiacetona quinasa,

ii) una secuencia de nucleótidos codificante de una aldolasa monomérica, preferentemente de Staphylococcus carnosus, y

iii) una secuencia de nucleótidos codificante de una secuencia conectora L intercalada entre las secuencias i) y ii).

8. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 7 caracterizada porque la secuencia de nucleótidos de la aldolasa es la fructosa 1,6-bifosfato aldolasa monomérica de la bacteria Staphylococcus carnosus y la dihidroxiacetona quinasa es la dihidroxiacetona quinasa de la bacteria Citrobacter freundii cepa CECT 4626.

9. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 7 caracterizada porque la secuencia de nucleótidos de la aldolasa y de la quinasa pueden contener la secuencia completa o de un fragmento de dicha secuencia, o una secuencia de nucleótidos análoga, o una secuencia de nucleótidos que codifica para una variante, natural o artificial, o de un fragmento de la misma, procede de cualquier microorganismo.

10. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 7 caracterizada porque la secuencia de nucleótidos de la quinasa procede de cualquier microorganismo.

11. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 7 caracterizada porque la región conectora L es la secuencia Gln-Gly-Gln-Gly-Gln.

12. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 7 caracterizada por presentar la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1.

13. Vector de expresión caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 7 a la 12, preferentemente un plásmido.

14. Vector de expresión según la reivindicación 13 caracterizado porque comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1.

15. Célula o microorganismo transformado caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 7 a la 12 o un vector según cualquiera de las reivindicaciones 13 y 14.

16. Célula o microorganismo transformado según la reivindicación 15 caracterizado porque comprende la secuencia SEQ ID NO:1.

17. Uso de la proteína quimérica según las reivindicaciones 1 a la 5 en una reacción de adición aldólica a partir de una dihidroxiacetona donadora y un aldehído aceptor, para la obtención de nuevos compuestos químicos.

18. Uso de la proteína quimérica según la reivindicación 17 caracterizado porque el enzima presenta la secuencia SEQ ID NO:2.