MÉTODOS DE DETECCIÓN DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER.

La presente invención se refiere a métodos de diagóstico o de pronóstico de la enfermedad de Alzheimer. Se refiere igualmente a los equipos de diagnóstico o de pronóstico de la enfermedad de Alzheimer. La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a una gran proporción de la población de mayor edad. Esta enfermedad se caracteriza a nivel clínico por la pérdida de las funciones cognitivas, y a nivel neuropatológico por la presencia en el cerebro de depósitos neurofibrilares intracelulares y de depósitos extracelulares del péptido ß-amiloide (Aß) que forma las placas amiloides. Las placas amiloides están compuestas mayoritariamente por péptidos Aß de 40 ó 42 aminoácidos que se generan por un proceso proteolítico de la proteína precursora del péptido ß-amiloide (APP) Los depósitos extracelulares de Aß son específicos de la enfermedad de Alzheimer. Representan la característica precoz e invariable de todas las formas de la enfermedad de Alzheimer, incluyendo las formas familiares. Las formas familiares de la enfermedad aparecen de manera relativamente precoz (entre 40 y 60 años). Parecen ser debidas, al menos en parte, a mutaciones en el gen del APP y en los genes de la presenilina-1 (PS1) y de la presenilina-2 (PS2). Las mutaciones en esos tres genes inducen cambios en la proteolisis del APP, que conduce a una superproducción de Aß y a la aparición precoz de la patología y de los síntomas que son similares a los de las formas esporádicas de la enfermedad de Alzheimer. Una conexión entre el colesterol y la enfermedad de Alzheimer fue establecida igualmente a partir de estudios epidemiológicos y de los resultados de estudios bioquímicos y de biología celular recientes (véase revista Hartmann, T. (2001) TINS 24 : S45-48). Una tasa elevada de colesterol en edad adulta, así como una tensión arterial elevada incrementan significativamente el riesgo de enfermedad de Alzheimer (Kivipelto et al., 2001 Br Med J. 322 : 1447). Por el contrario, un riesgo muy disminuido se registró en la población bajo tratamiento con los agentes hipocolesterolemiantes de tipo estatinas (Wolozin et al. (2000) Arch Neurol. 57 : 1439; Jick et al. (2000) Lancet 356 : 1627). La conexión molecular parece haber sido establecida recientemente. En vitro y en vivo, una tasa elevada de colesterol aumenta la producción del péptido A-ß y acelera la aparición de placas amiloides (Sparks et al. (1994) Exp. Neurol. 126 : 88-94; Refolo et al. (2000) Neurobiol. Dis. 7 : 321-331; Puglielli et al.(2001) Nat. Cell Biol. 3 : 905; (Shie et al., 2002) Neuroreport 13 : 455), mientras que los inhibidores de la vía de síntesis del colesterol las disminuyen (Simons et al. (1998) PNAS USA 95 : 6460-6464; Fassbender et al. (2001) PNAS USA 98 : 5856 Refolo et al. (2001) Neurobiol. Dis. 8 : 890-899). A pesar de los avances significativos, el cuerpo médico está siempre confrontado a la falta de moléculas realmente eficaces contra la enfermedad de Alzheimer. Paleacu et al, Clin. Neuropharm. Vol 25, págs.313-317 (2002) describe especialmente la utilización de un cierto tipo de tratamiento para los síntomas del comportamiento de la enfermedad de Alzheimer. Una de las razones de esta falta reside en la dificultad de encontrar dianas que permitan una selección de alta calidad de moléculas susceptibles de ejercer una acción terapéutica contra esta enfermedad. Por otra parte, la detección precoz de esta enfermedad resulta determinante con el fin de aportar un tratamiento antes de que se manifiesten los primeros síntomas, altamente invalidantes para los enfermos. Además, por el hecho de las variadas formas de esta enfermedad resulta necesario seleccionar el tratamiento en función, por una parte de los individuos a tratar y, por otra parte de la molécula susceptible de ser utilizada para el tratamiento. Esta razón farmacogenómica o farmacogenética resulta cada vez más importante. La proteína ABCA2 es una proteína perteneciente a la numerosa familia de los transportadores de colesterol de tipo ABC (ATP binding cassette). Este transportador se expresa específicamente en el cerebro. La clonación del gen ABCA2 fue descrita en 2000 por Zhao et al (Biochem. J., 350, 865-872). La secuencia es además objeto de la solicitud PCT WO 01/14414, depositada por la sociedad ACTIVEPASS PHRMACEUTICALS. Diversas hipótesis se formulan en esta solicitud en cuanto al papel del ABCA2, pero sin que ningún resultado las llegue a apoyar. La solicitud de PCT WO 02/064781 cita en cuanto a ella a una conexión entre un transportador ABC y la expresión de la proteína precursora del amiloide. Ya han sido identificados diversos polimorfismos del gen ABCA2. Sus secuencias son accesibles particularmente en la base de datos dbSNP del NCBI. El polimorfismo rs908832 está descrito entre los diferentes polimorfismos inscritos en esta base. Este polimorfismo se caracteriza por un alelo mayoritario en la población caucasiana, que es una guanina localizada en posición 348 en la secuencia SEQ ID N°2 y un alelo minoritario en la población caucasiana que es una adenina localizada en posición 348 en la secuencia SEQ ID N°1. 2   Alternativamente, este polimorfismo mononucleotídico está representado por las secuencias SEQ ID N°3 y SEQ ID N°4 en parte complementarias respectivamente de las secuencias SEQ ID N°1 y SEQ ID N°2. Este polimorfismo se caracteriza ahora por un alelo mayoritario en la población caucasiana, que es una citosina localizada en posición 201 en la secuencia SEQ ID N°4 y un alelo minoritario en la población caucasiana que es una timidina localizada en posición 201 en la secuencia SEQ ID N°3. Este polimorfismo es sinónimo, es decir que no modifica la secuencia de la proteína traducida. Los dos alelos del polimorfismo forman parte de los codones que codifican para un ácido aspártico. Este polimorfismo codificante está localizado en el exón 14 del transcrito que presenta la secuencia EQ ID N°5 en posición 2185. De manera sorprendente, la solicitante ha puesto de manifiesto que los individuos que presentan el alelo minoritario del polimorfismo rs908832 del gen ABCA2 tienen un riesgo acrecentado de desarrollar precozmente la enfermedad de Alzheimer. Este descubrimiento es particularmente importante puesto que aporta por primera vez, con conocimiento de la solicitante, la prueba de una conexión entre la proteína ABCA2 y, en particular, un polimorfismo del gen codificante para esta proteína, y un estado patológico tal como la enfermedad de Alzheimer. Permite confirmar y/o pronosticar la gravedad de la afección en los pacientes para los cuales ya fue diagnosticada la enfermedad de Alzheimer, así como la eficacia probable de los tratamientos previstos, o también pronosticar los riesgos de aparición de la enfermedad en caso de individuos que no presentan síntomas de la enfermedad de Alzheimer incluyendo los individuos emparentados con los pacientes cuyo diagnóstico ha sido confirmado. Permite, además, confirmar un mayor papel funcional de ABCA2 en la fisiopatología de la enfermedad de Alzheimer, justificando la realización de ensayos de selección de moléculas susceptibles de ejercer una acción estimulante o inhibidora sobre la actividad de ABCA2 con vistas a la aplicación terapéutica contra la enfermedad de Alzheimer. La presente invención tiene así como primer objeto un método de diagnóstico o de pronóstico de la enfermedad de Alzheimer en un individuo. Este método comprende al menos una etapa de detección de la presencia del polimorfismo rs908832. Individuos apropiados pueden ser, por ejemplo: las personas que no presentan síntomas de la enfermedad de Alzheimer, las personas en las cuales el riesgo de desarrollar la enfermedad de Alzheimer ya ha sido detectado, pero que no presentan todavía los síntomas de la enfermedad, y las personas que previamente han sido diagnosticadas como estar afectadas por la enfermedad de Alzheimer, para las cuales es deseable una confirmación del diagnóstico. La o las etapas de detección, simultáneas o no, de la presencia o de la ausencia del alelo minoritario del polimorfismo rs908832 se efectúan directa o indirectamente por cualquier medio adecuado a partir de muestras biológicas. Por tanto, la presente invención se refiere igualmente a un método de selección de muestras biológicas tomadas de los individuos que especialmente no presentan síntomas de la enfermedad de Alzheimer, para detectar a los individuos muy susceptibles de desarrollar la enfermedad de Alzheimer. Una selección de este tipo comprende la búsqueda, de manera simultánea o no, en dichas muestras biológicas, de la presencia del alelo minoritario del polimorfismo rs908832. Estas muestras que contienen los ADN o las proteínas a identificar pueden ser de diversos orígenes. Se puede tratar, por ejemplo, de muestras de sangre, de esperma, de cabellos (con sus raíces)... [Seguir leyendo]

1. Método de diagnóstico o de pronóstico de la enfermedad de Azheimer en un individuo, caracterizado porque comprende al menos una etapa de detección de la presencia del polimorfismo rs908832 del gen ABACA2. 2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dichas etapas de detección se efectúan a partir de muestras biológicas. 3. Método de diagnóstico o de pronóstico de la enfermedad de Alzheimer en un individuo según la reivindicación 2, caracterizado porque dichas muestras biológicas son muestras que contienen células nucleadas. 4. Método de diagnóstico o de pronóstico de la enfermedad de Alzheimer en un individuo según las reivindicaciones 2 o 3, caracterizado porque dichas muestras biológicas son muestras de sangre, de esperma o de cabello. 5. Método de diagnóstico o de pronóstico de la enfermedad de Alzheimer en un individuo según la reivindicación 1, caracterizado porque dichas etapas de detección de la presencia o ausencia de los ADN que portan el polimorfismo se efectúan por técnicas de reacción del polimerización en cadena (PCR), de hibridación, de transferencia de membrana por la técnica de Southern, de digestión por nucleasas, de polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), o de secuenciación directa, o su combinación. 6. Método según la reivindicación 5 caracterizado porque comprende: a. la extracción del ADN de dicho individuo a partir de una muestra biológica, b. la amplificación de dicho ADN aislado con ayuda de cebadores capaces de amplificar la secuencia correspondiente al polimorfismo rs908832 del gen ABCA2, c. la determinación de la presencia de al menos uno de los alelos del polimorfismo rs908832 del gen ABCA2 en el ADN amplificado. 7. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque la etapa de amplificación b) comprende una reacción de polimerización en cadena (PCR). 8. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque el ADN amplificado que porta el alelo minoritario T del polimorfismo rs908832 se distingue del ADN amplificado que no porta este alelo por la técnica que utiliza la actividad 5 nucleasa del ADN polimerasa I (TaqMan) 9. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque el ADN amplificado que porta el alelo minoritario T del polimorfismo rs908832 se distingue del ADN amplificado que no porta este polimorfismo por análisis del polimorfismo de los fragmentos de restricción (RFLP). 10. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque los fragnmentos de restrcción se obtuvieron por digestión del ADN amplificado con ayuda de una enzima de restricción antes de la migración en gel de agarosa, transferencia sobre membrana por la técnica de Southern e hibridación. 11. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la detección de la presencia del polimorfismo rs908832 del gen ABCA2 comprende la determinación del nucleótido en posición 2185 del transcrito codificante para la proteína ABCA2, presentando dicho transcrito la secuencia SEQ ID N° 5. 12. Animales transgénicos no humanos, de líneas de células madre no humanas y líneas de células diferenciadas a partir de estas líneas de células madre, en el genoma de los cuales se ha insertado al menos una secuencia de ADN exógeno genómico que porta el alelo minoritario "T del polimorfismo rs908832 del gen ABCA2.. 13. Animales transgénicos según la reivindicación 12, caracterizados porque se seleccionan entre los mamíferos no humanos. 14. Procedimiento de obtención de animales transgénicos, de líneas de células madre y líneas de células diferenciadas a partir de estas líneas de células madre, según una de las reivindicaciones 12 y 13, caracterizado porque comprende la generación de animales transgénicos, a excepción de los procedimientos que consisten o comprenden el crecimiento sexuado del conjunto del genoma de los anmimales, de líneas de células madre y de líneas de células diferenciadas a partir de estas líneas de células madre que comprenden el alelo minoritario del polimorfismo rs908832 del gen ABCA2 humano. 15. Utilzación de animales transgénicos, de líneas de células madre y líneas de células diferenciadas a partir de estas líneas de células madre, según una de las reivindicaciones 12 y 13 para ensayar la actividad de agentes o de métodos destinados a prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer. 16. Célula extraída de animales transgénicos tal como se describe en una de las reivindicaciones 12 y 13. 17. Utilización de una célula según la reivindicación 16, para la identificación de compuestos destinados al tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. 18