Soporte para la purificación de un ADN de doble hebra.

Soporte para la purificación de un ADN de doble hebra, caracterizado por que dicho soporte está acoplado demanera covalente a un oligonucleótido capaz de formar por hibridación una triple hélice con una secuenciaespecífica del ADN de doble hebra,

comprendiendo dicho oligonucleótido una secuencia homopirimídica elegidaentre la secuencia (CCT)n, la secuencia (CT)n, y la secuencia (CTT)n, en la que n es un número entre comprendidoentre 1 y 15, caracterizado por que el oligonucleótido contiene un brazo constituido por una cadena carbonada lineal(CH2)n, en donde n es un número entero comprendido entre 1 y 18, y por una amina capaz de formar un enlacecovalente con el soporte, y un espaciador compuesto de bases que no interfieren con la hibridación, estando unidodicho espaciador a la secuencia homopirimídica y al brazo, y estando unido dicho brazo al soporte.

Soporte para la purificación de un ADN de doble hebra La presente invención se refiere a un soporte para la purificación de ADN, tal como se describe en la reivindicación 1.

Las técnicas de terapia génica y celular conocen actualmente un desarrollo extraordinario. sin embargo, estas técnicas implican la posibilidad de producir cantidades importantes de ADN de pureza farmacéutica. En efecto, en estas nuevas terapias, el medicamento está a menudo constituido por el propio ADN, y es esencial poderlo fabricar, en cantidades adaptadas, aislarlo y purificarlo de manera apropiada a un uso terapéutico en el hombre.

Se describe un nuevo procedimiento simple y particularmente eficaz para la purificación de ADN. Permite 10 particularmente obtener purezas particularmente elevadas, con rendimientos elevados.

El procedimiento se basa esencialmente en una interacción específica entre una secuencia insertada sobre el ADN que se va a purificar y un oligonucleótido compuesto de bases naturales o modificadas.

Se ha mostrado recientemente que algunos oligonucleótidos son capaces de interaccionar específicamente en el gran surco de la doble hélice de ADN para formar localmente triples-hélices, que conducen a una inhibición de la 15 transcripción de genes-diana (Hélène et Toulmé, Biochim. Biophys. Acta 1049 (1990) 99) . Estos oligonucleótidos reconocen selectivamente la doble hélice de ADN al nivel de las secuencias de oligopurina.oligopirimidina, es decir, al nivel de regiones que poseen una secuencia oligopúrica sobre una hebra y una secuencia oligopirimídica sobre la hebra complementaria y forman allí localmente una triple hélice. Las bases de la tercera hebra (el oligonucleótido) forman enlaces de hidrógeno (enlaces Hoogsteen o Hoogsteen inverso) con las purinas de los pares de bases Watson-Crick.

En la técnica anterior se ha descrito una utilización de este tipo de interacción para aislar un plásmido. Así, Ito et al. (PNAS 89 (1992) 495) describen la utilización de oligonucleótidos biotinilados capaces de reconocer una secuencia determinada de un plásmido y de formar con ésta una triple hélice. Los complejos así formados se ponen en contacto a continuación con bolas magnéticas revestidas de estreptavidina. La interacción entre la biotina y la estreptavidina permite entonces aislar el plásmido por separación magnética de las bolas y a continuación elución. Sin embargo, este procedimiento presenta algunos inconvenientes. En particular, son necesarias dos interacciones específicas sucesivas, la primera entre el oligonucleótido y el plásmido, la segunda entre el complejo biotinilado y las bolas de estreptavidina. Además, la disolución final puede estar contaminada por el oligonucleótido biotinilado, que no se puede utilizar en una composición farmacéutica.

Se describe un procedimiento mejorado de purificación de ADN que recurre a este tipo de interacción. Más particularmente, el procedimiento utiliza oligonucleótidos acoplados de manera covalente a un soporte. Este procedimiento es particularmente rápido y conduce a rendimientos y a grados de pureza particularmente elevados. Además, permite purificar el ADN a partir de mezclas complejas que comprenden particularmente otros ácidos nucleicos, proteínas, endotoxinas (tales como lipopolisacáridos) , nucleasas, etc.... Los soportes utilizados pueden además reciclarse fácilmente, y los ADN obtenidos presentan propiedades de seguridad farmacéutica mejoradas. Por último, este procedimiento implica una sola etapa contrariamente a la técnica anterior.

Bien un procedimiento para la purificación del ADN de doble-hebra, según el cual se hace pasar una disolución que contiene dicho ADN mezclado con otros componentes sobre un soporte en el que está acoplado de manera covalente un oligonucleótido capaz de formar por hibridación una triple hélice con una secuencia específica presente sobre dicho ADN. La secuencia específica puede ser una secuencia presente naturalmente sobre el ADN de doblehebra, o una secuencia sintética introducida artificialmente en éste.

Los oligonucleótidos utilizados en la presente descripción son oligonucleótidos que hibridan directamente con el ADN de doble-hebra. Estos oligonucleótidos pueden contener las siguientes bases:

! timidina (T) , que es capaz de formar tripletes con los dobletes A.T del ADN de doble-hebra (Rajagopal et al, 45 Biochem 28 (1989) 7859) ;

! adenina (A) , que es capaz de formar tripletes con los dobletes A.T del ADN de doble-hebra;

! guanina (G) , que es capaz de formar tripletes con los dobletes G.C del ADN de doble-hebra;

! citosina protonada (C+) , que es capaz de formar tripletes con los dobletes G.C del ADN de doble hebra (Rajagopal et al citado anteriormente) ;

! uracilo (U) que es capaz de formar tripletes con los pares de bases A.U o A.T.

Preferentemente, el oligonucleótido utilizado comprende una secuencia homopirimídica rica en citosinas y la secuencia específica presente sobre el ADN es una secuencia homopúrica-homopirimídica. La presencia de citosinas permite tener una triple hélice estable a pH ácido, donde las citosinas se protonan, y desestabilizada a pH alcalino, donde las citosinas se neutralizan.

Para permitir la formación de una triple-hélice por hibridación, es importante que el oligonucleótido y la secuencia específica presente sobre el ADN sean complementarias. A este respecto, para obtener los mejores rendimientos y 5 la mejor selectividad, en el procedimiento de la invención se utiliza un oligonucleótido y una secuencia específica perfectamente complementarias. Se puede tratar en particular de un oligonucleótido poli-CTT y de una secuencia específica poli-GAA. Como ejemplo, se puede citar el oligonucleótido de secuencia 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (GAGG (CTT) 7; (SEQ ID n°1) , en el que las bases GAGG no forman triple hélice sino que permiten espaciar el oligonucleótido del brazo de acoplamiento; se puede igualmente citar la secuencia (CTT) 7 (SEQ ID n°26) . Estos oligonucleótidos son capaces de formar una triple-hélice con una secuencia específica que consta de restos complementarios (GAA) . Se puede tratar en particular de una región que consta de 7, 14 o 17 restos GAA, como se describe en los ejemplos.

Otra secuencia de interés específica es la secuencia :

5'-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3' (SEQ ID n°5) .

Esta secuencia forma una triple hélice con los oligonucleótidos 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (SEQ ID n°6) o 5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3' (SEQ ID n°7) .

En este caso, el oligonucleótido se fija en una orientación antiparalela a la hebra polipúrica. Estas triples hélices solo son estables en presencia de Mg2+ (Vasquez et al., Biochemistr y , 1995, 34, 7243-7251 ; Beal et Dervan, Science,

1991, 251, 1360-1363) .

Como se ha indicado anteriormente, la secuencia específica puede ser una secuencia presente naturalmente sobre el ADN de doble-hebra, o una secuencia sintética introducida artificialmente en éste. Es particularmente interesante utilizar un oligonucleótido capaz de formar una triple-hélice con una secuencia presente naturalmente sobre el ADN de doble-hebra, por ejemplo en el origen de replicación de un plásmido o en un gen marcador. A este respecto, la 25 solicitante ha efectuado análisis de secuencia de plásmidos y ha podido demostrar que algunas regiones de estos ADN, particularmente en el origen de replicación, podían poseer regiones homopuricahomopirimídicas. La síntesis de oligonucleótidos capaces de formar triples-hélices con estas regiones homopurico-homopirimídicas naturales permite ventajosamente aplicar el procedimiento de la invención a plásmidos no modificados, particularmente plásmidos comerciales de tipo pUC, pBR322, pSV, etc. Entre las secuencias homopuricas-homopirimídicas 30 naturalmente presentes sobre un ADN de doble hebra, se puede citar una secuencia que comprende todo o parte de la secuencia 5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (SEQ ID n°2) presente en el origen de replicación ColE1 de E. coli. En este caso, el oligonucleótido que forma la triple hélice posee la secuencia : 5'-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3' (SEQ ID n°3) y se fija alternativamente sobre las dos hebras de la doble hélice, como es descrito por Beal y Dervan (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976-4982) y Jayasena y Johnston (Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279-5288) . Se puede citar también la secuencia 5'-GAAAAAGGAAGAG-3' (SEQ ID n°4) del gen de la β-lactamasa del plásmido pBR322 (Duval-Valentin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 1992, 89, 504-508) . La utilización de un oligonucleótido capaz de formar una triple-hélice con una secuencia presente en un origen de replicación o un gen marcador es particularmente ventajosa porque... [Seguir leyendo]

1. Soporte para la purificación de un ADN de doble hebra, caracterizado por que dicho soporte está acoplado de manera covalente a un oligonucleótido capaz de formar por hibridación una triple hélice con una secuencia específica del ADN de doble hebra, comprendiendo dicho oligonucleótido una secuencia homopirimídica elegida entre la secuencia (CCT) n, la secuencia (CT) n, y la secuencia (CTT) n, en la que n es un número entre comprendido entre 1 y 15, caracterizado por que el oligonucleótido contiene un brazo constituido por una cadena carbonada lineal (CH2) n, en donde n es un número entero comprendido entre 1 y 18, y por una amina capaz de formar un enlace covalente con el soporte, y un espaciador compuesto de bases que no interfieren con la hibridación, estando unido dicho espaciador a la secuencia homopirimídica y al brazo, y estando unido dicho brazo al soporte.

2. Soporte según la reivindicación 1, caracterizado por que el oligonucleótido comprende citosinas metiladas.

3. Soporte según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el soporte es un soporte de cromatografía funcionalizado, un soporte constituido por superficies plásticas funcionalizadas o un soporte constituido por bolas de látex funcionalizadas.

4. Soporte según la reivindicación 3, caracterizado porque el soporte es un soporte de cromatografía funcionalizado

elegido entre agarosa, acrilamida, Dextrano, derivados de acrilamida, derivados de Dextrano, poli (estirendivinilbenceno) , sílice injertada y sílice no injertada.

5. Soporte según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el oligonucleótido comprende una secuencia elegida entre las secuencias SEQ ID NO: 1, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, y SEQ ID NO: 26.

6. Procedimiento de preparación de un soporte según la reivindicación 1, que consiste en acoplar de manera covalente el oligonucleótido sobre dicho soporte.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado por que el oligonucleótido comprende citosinas metiladas.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado por que el oligonucleótido está funcionalizado.

9. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado por que el oligonucleótido está modificado por un grupo terminal tiol, amino o carboxilo en posición 5' o en 3'.

10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado porque el soporte es un soporte de cromatografía funcionalizado, un soporte constituido por superficies plásticas funcionalizadas o bolas de látex funcionalizadas.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque el soporte es un soporte de cromatografía funcionalizado elegido entre agarosa, acrilamida, Dextrano, derivados de acrilamida, derivados de Dextrano, poli (estirendivinilbenceno) , sílice injertada y sílice no injertada.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado por que el soporte lleva funciones disulfuro, maleimido, amino, carboxilo, éster, epóxido, bromuro de cianógeno o aldehído.

13. Procedimiento de preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, caracterizado por que dicho oligonucleótido comprende una secuencia elegida entre las secuencias SEQ ID Nº: 1, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, y SEQ ID NO: 26.