UTILIZACIÓN DE SONDAS OLIGONUCLEOTÍDICAS Y PROCEDIMIENTO PARA LA TIPIFICACIÓN GENÓMICA DE LOS SISTEMAS ERITROCITARIOS.

Utilización de por lo menos un conjunto de sondas oligonucleotídicas modificadas con amino en el extremo 5',

caracterizada porque presentan una longitud de secuencia comprendida entre 18 y 20 nucleótidos que contienen en o en la proximidad al centro de la secuencia de la sonda el SNP específico para cada uno de los alelos diana que pertenecen al locus genómico X, seleccionados de entre K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb, Lua/Lub, S/s, Coa/Cob, Fya/Fyb, Jka/Jkb que pueden hibridar específicamente con cada uno de dichos alelos; estando dichas sondas caracterizadas porque están acopladas a una microesfera marcada con por lo menos una sustancia fluorescente y porque comprenden o están constituidas por lo menos por un conjunto de secuencias de oligonucleótidos indicadas en la siguiente tabla: Sonda Conjunto de sondas Número de conjunto k K NC Kpb Kpa NC Jsb Jsa NC Lua Lub NC s S NC Coa Cob NC Fya Fyb NC Jka Jkb NC TTAACCgAACgCTgAgAC (SEC ID nº:17) TTAACCgAATgCTgAgAC (SEC ID nº: 18) CTATCCCAAAgCTAAggC (SEC ID nº:19) ATCACTTCACggCTgTTCCA (SEC ID nº:20) TCACTTCATggCTgTTCCAg (SEC ID nº:21) AACTCTACAgggCTCTTCgA (SEC ID nº:221 ggCTgCCTCgCCTgTgACAA (SEC ID nº:23) ggCTgCCCCgCCTgTgACAA (SEC ID nº:24) gCCAgCCACgCgTgTCACTA (SEC ID nº:25) TCgCCCCCgCCTAgCCTC (SEC ID nº:26) TCgCCCCCACCTAgCCTC (SEC ID nº:27) TAgCCTCCTCCAAgACTA (SEC ID nº:28) TAggAgAAACgggACAACTT (SEC ID nº:29) AggAgAAATgggACAACTTg (SEC ID nº:30) TCggATAAAAgAgACCACTg (SEC ID nº:31) AACCAgACggCggTCCAggA (SEC ID nº:32) CAACCAgACggTggTCCAgg (SEC ID nº:33) AgCCACACTggggACCTggA (SEC ID nº:34) GAgACTATggTgCCAACCTg (SEC ID nº:35) TggAgACTATgATgCCAACC (SEC ID nº:36) GAggCTATCCTgACAAgCTT (SEC ID nº:37) AgTAgATgTCCTCAAATg (SEC ID nº:38) AgTAgATgTTCTCAAATg (SEC ID nº:39) CgTgggATTTCTTCAgAgg (SEC ID nº:40) en la que dichos conjuntos de sondas oligonucleotídicas se utilizan a las temperaturas de hibridación específicas indicadas en la tabla siguiente: Número de conjunto THIBRIDACIÓN 1 45ºC 2 54ºC 3 54ºC 4 45ºC 5 54ºC 6 64ºC 7 54ºC 8 37ºC para la identificación y tipificación de por lo menos un SNP del par alélico X siguiente seleccionado de entre K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb, Lua/Lub, S/s, Coa/Cob, Fya/Fyb, Jka/Jkb

La presente invención se refiere a un procedimiento para la tipificación genómica de sistemas eritrocitarios, y a la utilización de sondas oligonucleotídicas. Se dan asimismo a conocer kits de diagnóstico relacionados.

La tipificación del grupo sanguíneo se ha realizado tradicionalmente con técnicas de aglutinación utilizando diversos procedimientos tales como tecnología de microplacas de fase sólida/líquida, columnas, tubos y portaobjetos con 5 antisueros comerciales tanto policlonales como monoclonales.

Las diversas técnicas de aglutinación que pueden aplicarse en todos los laboratorios competentes presentan una sensibilidad y especificidad apropiada en la utilización clínica para la mayoría de los casos.

Sin embargo, debido a las limitaciones en la hemaglutinación, resulta habitual en la actualidad en los laboratorios de referencia complementar y apoyar la tipificación serológica del grupo sanguíneo con técnicas moleculares y en muchos 10 casos constituyen el único procedimiento alternativo que puede solucionar los problemas complejos.

Existen diversas aplicaciones en la práctica de la medicina de transfusión.

La mayoría de las aplicaciones clínicas responden apropiadamente a la exigencia de realizar una tipificación correcta del grupo sanguíneo del paciente en un corto periodo de tiempo y en relación con sujetos inmunizados de manera múltiple con patologías autoinmunitarias, con pacientes transfundidos inmediatamente antes de la prueba del grupo 15 sanguíneo y/o pacientes dependientes de transfusión tales como pacientes talasémicos (ref.1 Castilho L. et al. 2002; ref.2 Montalvo L. et al. 2004). En estos casos, la tipificación con procedimientos clásicos podría resultar de difícil aplicación. Para la primera categoría de pacientes, surgen dificultades debido a la presencia de anticuerpos que se adhieren a los eritrocitos que requieren análisis adicionales y diferentes procedimientos de tipificación en la parte del laboratorio para análisis inmunohematológicos, prolongando considerablemente el tiempo de análisis que resulta 20 valioso en situaciones de urgencia. En la segunda categoría de pacientes transfundidos inmediatamente antes de la prueba del grupo sanguíneo, el problema se debe a la presencia de cantidades masivas de eritrocitos transfundidos del donante en la circulación del paciente, imposibilitando la aplicación de los procedimientos clásicos. Por tanto, en este caso, una tipificación correcta del fenotipo de RH del paciente y de otros antígenos de glóbulos rojos comunes (por ejemplo, K/k; Fya/Fyb; Jka/Jkb; S/s) frente a los que el desarrollo de anticuerpos puede presentar un significado clínico 25 relevante, es extremadamente útil para confirmar la naturaleza de los anticuerpos identificados tanto en el suero como adheridos a los eritrocitos y en consecuencia para proporcionar el mejor apoyo a la transfusión posible para el paciente.

Existen otras aplicaciones interesantes de la tipificación molecular de sistema eritrocitarios. Estas incluyen la confirmación y a veces la única fuente de resolución en casos de antígenos con expresión débil tales como el antígeno 30 D (sistema RH) o el antígeno FyX (sistema Duffy); la caracterización de formas nulas; la determinación de D-cigosidad no posible de otra forma y la resolución en casos de variantes de ABO.

Otra aplicación importante se refiere asimismo a la posibilidad de confirmar, con técnicas moleculares, la tipificación de eritrocitos raros de pacientes o donantes de sangre que son negativos para los antígenos de alta incidencia. Una persona que presenta un fenotipo raro puede inmunizarse frente al antígeno restante tras la transfusión, el embarazo y 35 en un menor grado el trasplante de órganos. La inmunización frente a un antígeno de alta incidencia también puede complicar considerablemente la detección de anticuerpos del grupo sanguíneo adicionales. La presencia de anticuerpos que presentan diferentes especificidades hace que el proceso de identificación resulte laborioso y complicado y que el hallazgo de unidades sanguíneas compatibles resulte extremadamente problemático.

La posibilidad de congelar unidades de sangre tipificadas en el momento en el que se necesitan facilita 40 considerablemente el tratamiento del paciente, sin tener que recurrir a la tipificación al azar de un alto número de donantes en condiciones de urgencia, también con el riesgo de no encontrar la unidad compatible. Podrían congelarse y aislarse unidades de sangre poco comunes para pacientes en riesgo. Además, también debe considerarse que las diferencias étnicas entre donante y paciente podrían crear problemas mayores, especialmente si el paciente requiere un régimen de transfusión a largo plazo. 45

Para este fin, la utilización de técnicas moleculares solucionará el problema del alto coste de los antisueros poco comunes y a veces, para algunas especificidades, también resuelve el problema tanto de falta de como de reactividad débil de estos antisueros fácilmente perecederos tales como los antisueros específicos para el sistema Dombrock (ref. 3 Reid et al. 2002).

Una importante ventaja de los métodos de ADN consiste en la posibilidad de obtener una cantidad de ADN útil a partir 50 tanto de sangre periférica, incluso a partir de cantidades mínimas, como de otras fuentes biológicas. Además, si las muestras de ADN se conservan apropiadamente, son estables a lo largo de un periodo de tiempo largo. El trabajo con ADN en medicina de transfusión presenta también la considerable ventaja de no estar limitado porque la muestra deba procesarse inmediatamente tal como requiere la serología clásica.

Se han desarrollado diversas técnicas aplicadas en el campo de la medicina de transfusión para todas estas 55 aplicaciones posibles. En particular, para la genotipificación del grupo sanguíneo, las técnicas más comunes utilizadas en laboratorios de inmunohematología son PCR-RFLP (polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción) y PCR-

SSP (cebadores específicos de secuencia).

Se han desarrollado recientemente nuevos procedimientos tales como PCR-ELISA, PCR en tiempo real, análisis de minisecuenciación de SNP (ref.4 Ferri EG et al., 2006) y tecnología de micromatrices (ref. 5 Denomme G. et al., 2005). Esta última tecnología en particular surge de la necesidad de tipificar un mayor número de muestras con respecto a otras técnicas disponibles que presentaban un bajo rendimiento. 5

Desde luego, el principio de esta técnica no es totalmente nuevo. Las técnicas de transferencia de tipo Southern, por ejemplo, proporcionan el análisis de un gran número de muestras mediante hibridación de fragmentos de ADN pero por medio de electroforesis. La principal diferencia subyace en el tipo de material utilizado como soporte de hibridación; se han reemplazado las membranas de hibridación porosas por un soporte de vidrio o silicio no poroso o microesferas marcadas con fluorescencia (ref. 6 Petrik J. 2001). Estos cambios han permitido que los volúmenes de reactivos se 10 reduzcan considerablemente, mejorando la cinética de hibridación, miniaturizando el proceso completo, aumentando el rendimiento y permitiendo la posibilidad de someter a prueba varios analitos al mismo tiempo en una única reacción. Todos estos cambios revolucionarios reducen considerablemente el tiempo del operario, la laboriosidad y el coste.

En los últimos años se ha desarrollado una variedad de aplicaciones de la tecnología de micromatrices. Esta tecnología se aplica tanto en análisis genéticos como en serología. 15

La tecnología de micromatrices, tal como se aplica en este caso, se caracteriza por una fase de amplificación de la región de ADN diana, seguida por desnaturalización, hibridación con sondas específicas complementarias al polimorfismo diana y detección de fluorescencia y análisis de datos por medio de citometría de flujo tras el marcaje adecuado con ficoeritrina-estreptavidina. Con la tecnología de micromatrices utilizando un soporte de hibridación sólido, es posible tipificar antígenos de los sistemas ABO y RH así como también antígenos de alta incidencia y 20 clínicamente significativos. Esta tecnología también se ha aplicado a la tipificación genómica de antígenos plaquetarios (ref. 7 Beiboer S. et al., 2005). Además, la utilización de técnicas de aglutinación implica alto coste en el caso de examen en masa para antígenos de eritrocitos de alta incidencia con el fin de obtener donantes negativos, ya que la disponibilidad de reactivos de tipificación... [Seguir leyendo]

1. Utilización de por lo menos un conjunto de sondas oligonucleotídicas modificadas con amino en el extremo 5', caracterizada porque presentan una longitud de secuencia comprendida entre 18 y 20 nucleótidos que contienen en o en la proximidad al centro de la secuencia de la sonda el SNP específico para cada uno de los alelos diana que pertenecen al locus genómico X, seleccionados de entre K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb, Lua/Lub, S/s, Coa/Cob, Fya/Fyb, 5 Jka/Jkb que pueden hibridar específicamente con cada uno de dichos alelos; estando dichas sondas caracterizadas porque están acopladas a una microesfera marcada con por lo menos una sustancia fluorescente y porque comprenden o están constituidas por lo menos por un conjunto de secuencias de oligonucleótidos indicadas en la siguiente tabla:

Sonda

Conjunto de sondas

Número de conjunto

k

K

NC

TTAACCgAACgCTgAgAC (SEC ID nº:17)

TTAACCgAATgCTgAgAC (SEC ID nº: 18)

CTATCCCAAAgCTAAggC (SEC ID nº:19)

1

Kpb

Kpa

NC

ATCACTTCACggCTgTTCCA (SEC ID nº:20)

TCACTTCATggCTgTTCCAg (SEC ID nº:21)

AACTCTACAgggCTCTTCgA (SEC ID nº:221

2

Jsb

Jsa

NC

ggCTgCCTCgCCTgTgACAA (SEC ID nº:23)

ggCTgCCCCgCCTgTgACAA (SEC ID nº:24)

gCCAgCCACgCgTgTCACTA (SEC ID nº:25)

3

Lua

Lub

NC

TCgCCCCCgCCTAgCCTC (SEC ID nº:26)

TCgCCCCCACCTAgCCTC (SEC ID nº:27)

TAgCCTCCTCCAAgACTA (SEC ID nº:28)

4

s

S

NC

TAggAgAAACgggACAACTT (SEC ID nº:29)

AggAgAAATgggACAACTTg (SEC ID nº:30)

TCggATAAAAgAgACCACTg (SEC ID nº:31)

5

Coa

Cob

NC

AACCAgACggCggTCCAggA (SEC ID nº:32)

CAACCAgACggTggTCCAgg (SEC ID nº:33)

AgCCACACTggggACCTggA (SEC ID nº:34)

6

Fya Fyb NC

GAgACTATggTgCCAACCTg (SEC ID nº:35)

TggAgACTATgATgCCAACC (SEC ID nº:36)

GAggCTATCCTgACAAgCTT (SEC ID nº:37)

7

Jka Jkb NC

AgTAgATgTCCTCAAATg (SEC ID nº:38)

AgTAgATgTTCTCAAATg (SEC ID nº:39)

CgTgggATTTCTTCAgAgg (SEC ID nº:40)

8

10

en la que dichos conjuntos de sondas oligonucleotídicas se utilizan a las temperaturas de hibridación específicas indicadas en la tabla siguiente:

Número de conjunto

THIBRIDACIÓN

1

45ºC

2

54ºC

3

54ºC

4

45ºC

5

54ºC

6

64ºC

7

54ºC

8

37ºC

para la identificación y tipificación de por lo menos un SNP del par alélico X siguiente seleccionado de entre K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb, Lua/Lub, S/s, Coa/Cob, Fya/Fyb, Jka/Jkb. 15

2. Procedimiento para la identificación y tipificación de por lo menos un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) del sistema eritrocitario X en individual heterocigotos y homocigotos, que comprende las fases siguientes:

a) extraer ADN de una muestra biológica;

b) amplificar por PCR el locus genómico que comprende el SNP del sistema eritrocitario de interés, por medio de por lo menos un par de cebadores específico para un alelo diana seleccionado de entre: 20

Alelos diana

Secuencia del cebador (5'-3')

K/k

Directo: TTTAgTCCTCACTCCCATgCTTCC (SEC ID nº:1)

Inverso: TATCACACAggTgTCCTCTCTTCC (SEC ID nº:2)

Kpa/Kpb

Directo: TgAggCCAggAgAAAAgCA (SEC ID nº:3)

Inverso: TgACCATCTggAAgAgCTTgC (SEC ID nº:4)

Jsa/Jsb

Directo: AACTTTgCCATgCTCCTgg (SEC ID nº:5)

Inverso: gCCCTTgACACTTgCATACCT (SEC ID nº:6)

Lua/Lub

Directo: CTgAggAgCgCTgggACACCCgg (SEC ID nº:7)

Inverso: CCCCgggTgTCgTgCATT (SEC ID nº:8)

S/s

Directo: AAgACTgACACATTACCTCA (SEC ID nº:9)

Inverso: AACATACCTggTACAgTgAA (SEC ID nº:10)

Coa/Cob

Directo: TATAAATAggCCCAgCCCAg (SEQ ID NO.11)

Inverso: CCAgCgACACCTTCACgTT (SEC ID nº: 12)

Fya/Fyb

Directo: CTTCCggTgTAACTCTgATgg (SEC ID nº:13)

Inverso: CATCCAgCAggTTACAggAgT (SEC ID nº:14)

Jka/Jkb

Directo: CATgCTgCCATAggATCATTgC (SEC ID nº: 15)

Inverso: gAgCCAggAggTgggTTTgC (SEC ID nº:16)

en el que por lo menos un cebador está marcado en el extremo 5' con biotina para obtener los productos de PCR biotinilados;

c) hibridar los productos de PCR biotinilados obtenidos en la fase b) utilizando por lo menos un conjunto de 5 sondas oligonucleotídicas según la reivindicación 1 y marcando con estreptavidina-ficoeritrina a la temperatura específica para cada sistema tal como se indica en la tabla siguiente:

Sonda

Conjunto de sondas

THIBRIDACIÓN

k

K

NC

TTAACCgAACgCTgAgAC

TTAACCgAATgCTgAgAC

CTATCCCAAAgCTAAggC

45ºC

Kpb

Kpa

NC

ATCACTTCACggCTgTTCCA

TCACTTCATggCTgTTCCAg

AACTCTACggggCTCTTCgA

54ºC

Jsb

Jsa

NC

ggCTgCCTCgCCTgTgACAA

ggCTgCCCCgCCTgTgACAA

gCCAgCCACgCgTgTCACTA

54ºC

Lua

Lub

NC

TCgCCCCCgCCTAgCCTC

TCgCCCCCACCTAgCCTC

TAgCCTCCTCCAAgACTA

45ºC

s

S

NC

TAggAgAAACgggACAACTT

AggAgAAATgggACAACTTg

TCggATAAAAgAgACCACTg

54ºC

Coa

Cob

NC

AACCAgACggCggTCCAggA

CAACCAgACggTggTCCAgg

AgCCACACTggggACCTggA

64ºC

Fya

Fyb

NC

gAgACTATggTgCCAACCTg

TggAgACTATgATgCCAACC

gAggCTATCCTgACAAgCTT

54ºC

Jka

Jkb

NC

AgTAgATgTCCTCAAATg

AgTAgATgTTCTCAAATg

CgTggATTTCTTCAgAgg

37ºC

e) revelar la fluorescencia con un instrumento basado en un citómetro de flujo.