PAR DE SONDAS OLIGONUCLEOTÍDICAS PARA EL GENOTIPADO DEL SISTEMA ERITROCITARIO KIDD/JK, PROCEDIMIENTOS Y KITS DE DIAGNÓSTICO CORRESPONDIENTES.

Par de sondas oligonucleotídicas modificado con amino en el terminal 5' que presenta una longitud de la secuencia comprendida entre 16 y 20 nucleótidos,

estando dicha secuencia caracterizada porque comprende, en el centro, el polimorfismo de un solo nucleótido (PSN) específico de las variantes alélicas del gen que codifica dicho polimorfismo y dichas sondas oligonucleotídicas que hibridan con dichos alelos, en el que dicho gen es el gen Kidd y dichas sondas están constituidas por las secuencias siguientes: a) 5' -AmC12AGT AGA TGT CCT CAA ATG-3' (SEC. ID. nº 1); b) 5' -AmC12AGT AGA TGT TCT CAA ATG-3' (SEC. ID. nº 2); o las secuencias complementarias a éstas

Par de sondas oligonucleotídicas para el genotipado del sistema eritrocitario Kidd/Jk, procedimientos y kits de diagnóstico correspondientes.

La presente invención se refiere a pares de sondas oligonucleotídicas específicos para ser utilizados en procedimientos de genotipado de sistemas eritrocitarios y a los kits para diagnóstico correspondientes.

El tipado de sistemas antigénicos eritrocitarios se efectúa tradicionalmente con los procedimientos de aglutinación en fase líquida o en fase sólida utilizando antisueros policlonales o monoclonales comerciales. Esta técnica es sencilla, puede aplicarse en todos los laboratorios y presenta una sensibilidad y una especificidad apropiadas en uso clínico en la mayoría de los casos.

Las pruebas de aglutinación, sin embargo, presentan varias limitaciones principalmente relacionadas con la dificultad de evaluar el punto fuerte antigénico en algunas condiciones particularmente arriesgadas. Éstas son principalmente: a) el tipado de pacientes politransfundidos inmunizados; b) la identificación de un feto en situación de riesgo de enfermedad hemolítica del recién nacido debido a la presencia de anticuerpos maternos; c) la determinación de variantes débiles; d) la determinación de cigosidad para el antígeno RhD; e) la determinación de fenotipos nulos para antígenos de eritrocitos.

Por otra parte, la utilización de técnicas de aglutinación conlleva costes elevados en el caso de cribado en masa a fin de encontrar donantes negativos para antígenos de eritrocitos de gran incidencia. Para algunos de estos sistemas, la disponibilidad de reactivos de tipado comerciales es muy limitada o inexistente.

Una de las principales ventajas de las técnicas a base de ADN es independiente de los reactivos ya que los sueros para tipado se sustituyen por oligonucleótidos que pueden ser sintetizados químicamente a bajo coste.

Por esta razón, se han desarrollado varias técnicas basadas en el análisis de ADN para el tipado de sistemas eritrocitarios a escala molecular.

En particular, para el genotipado de sistemas antigénicos eritrocitarios, las técnicas más frecuentes utilizadas en inmunohematología son PCR-RFLP (Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción) y RCP-SSP (Cebadores específicos de secuencias) . Recientemente se han desarrollado nuevos procedimientos para el estudio de veintiocho de los veintinueve sistemas eritrocitarios cuya secuencia es conocida, tales como, por ejemplo, RCP-ELISA (para sistemas antigénicos RHD, RHCE, Kell, Duffy y Kidd) , RCP en tiempo real (para sistemas antigénicos Kidd y Dombrock) y la tecnología de chip. Aunque este desarrollo proporciona un soporte fundamental en los laboratorios de inmunohematología y en el campo de la medicina de transfusiones, la mayoría de las técnicas actualmente disponibles son inapropiadas para el análisis a amplia escala, son relativamente lentas y requieren un equipo sofisticado y costoso.

Las nuevas tecnologías actuales parece ser que apuntan a la automatización y simplificación y nuevos instrumentos se modifican para acelerar el proceso y maximizar la producción de datos.

Este último concepto resulta descriptivo de las dosis de citometría de flujo múltiples basadas en microesferas. Mediante la conjugación de varias sondas purificadas de Ag u oligonucleotídicas con distintas series de microesferas fluorescentes, pueden obtenerse sistemas analíticos muy eficaces, que permiten que se tomen numerosos analitos de una sola muestra. La cuantificación aprovecha el potencial resolutivo multiparamétrico de la citometría de flujo y la capacidad de los sistemas de tratamiento de las señales digitales que procesan los millares de señales fluorescentes generadas por las microesferas (Kellar, K.L., 2002; Kettman J.R. et al. 1998) .

Las microesferas están formadas por polímeros sintéticos y se caracterizan por una diferente intensidad de fluorescencia. Varias fuentes comerciales de microesferas fluorescentes están disponibles tales como Bangs Laboratories (Fishers, IN) , Duke Scientific (Palo Alto, CA) , Luminex Corporation (Austin, TX) , Polysciences (Warrington, PA) , Seradyn (Indianápolis, IN) y Spherotech (Libertyville, IL) que ofrecen microesferas con varias dimensiones y características fluorescentes.

Luminex Corporation, por ejemplo, produce 100 microesferas con diferentes intensidades de fluorescencia creadas mediante la incorporación de varias relaciones de dos fluorocromos que emiten a diferentes longitudes de onda y se miden con diferentes detectores (Fulton R.J. et al., 1997) . Recientemente se ha desarrollado un citómetro de flujo compacto (Luminex 100) , con dos fuentes de láser diseñadas para la detección de microesferas y cuantificación de fluorescencia y se ha producido una matriz de 100 microesferas coloreadas con orificios de flúor que emiten a 658 y 712 nm después de la estimulación con un láser de diodo rojo de 635 nm para complementar el sistema de láser del citómetro. (Spain M. et al., 2001; Earley M.C. et al., 2002) . Este sistema de caracterización de analitos múltiple (LabMAPTM) se ha utilizado para el análisis múltiple de varios polimorfismos de un solo nucleótido (PSN) (Ye F. et al., 2001: Colinas R.J. et al., 2000; Dunbar S.A. et al., 2000) . Los PSN son la fuente de variabilidad más abundante en el genoma humano y son por lo tanto importantes para identificar los locus específicos de determinadas

patologías o la sensibilidad de una persona hacia una enfermedad o terapia farmacológica específicas (Kellar K.L., 2003) .

Los PSN representan también la base molecular de los polimorfismos de muchos sistemas antigénicos tales como, por ejemplo, el sistema Kidd, que es uno de los principales sistemas antigénicos eritrocitarios humanos (Olives B. et al., 1997) .

El sistema eritrocitario Kidd está definido por dos alelos específicos, Jka y Jkb (Irshaid N.M. et al., 1998) . El polimorfismo (Jka/Jkb) consiste en la sustitución de un sólo nucleótido que determina una sustitución de aminoácidos (Asp280Asn) en el nivel del cuarto bucle extracelular de la glucoproteína Kidd. El locus de Kidd (alelo Jka , Jkb) , situado en el cromosoma 18q11-q12, codifica una glucoproteína íntegra de la membrana que transporta la urea a través de la membrana del eritrocito y que se expresa a nivel de las células endoteliales de los vasos rectos en el riñón (Irshaid N.M. et al., 1998) . El carácter hereditario de Jka y Jkb es codominante. Existe también un fenotipo “nulo” de Kidd (Jk (a-b-) ) , que procede de diferentes alteraciones genéticas (Irshaid N.M., 2000 ref. 15) , que hace resistentes los eritrocitos a la lisis de urea 2 M (Sidoux-Walter F., 2000; Lucien N. et al., 1998; 2002; Irshaid N.M., 2002 ref. 13) .

Los anticuerpos anti-Kidd, a menudo son difíciles de detectar, representan un grave riesgo en el campo de la transfusión. Han estado implicados en transfusiones hemolíticas inmediatas, graves y a veces mortales, y en numerosas reacciones de transfusión hemolíticas retardadas. Estas últimas reacciones pueden ser graves y producen oligouria, problemas renales que pueden conducir a veces a la muerte. Estas especificidades con frecuencia están presentes junto con otras y tienen la característica de disminuir rápidamente a bajas concentraciones en el plasma y por lo tanto son difíciles de identificar. Se estima que aproximadamente un tercio de las reacciones hemolíticas retardadas son producidas por anticuerpos hacia los antígenos Kidd.

Por último, la diferente frecuencia de los alelos del gen Kidd en diferentes poblaciones puede conducir más fácilmente a la producción de anticuerpos específicos si el donante y el receptor pertenecen a diferentes grupos étnicos.

Cuando son necesarios donantes compatibles para pacientes con anticuerpos, la determinación del fenotipo JK por medio de procedimientos serológicos resulta determinante en los donantes de sangre.

A partir de lo expuesto anteriormente, existe una demanda evidente de nuevos instrumentos biotecnológicos para el genotipado de sistemas eritrocitarios que superan los límites de las técnicas adoptadas actualmente.

En la presente invención se han identificado actualmente sondas oligonucleotídicas específicas que, cuando se modifican adecuadamente, una vez conjugadas a un soporte sólido, tal como por ejemplo una matriz de microesferas fluorescentes, puede utilizarse con ventaja en genotipado. La modificación apropiada de las sondas oligonucleotídicas es tal que permiten... [Seguir leyendo]

1. Par de sondas oligonucleotídicas modificado con amino en el terminal 5' que presenta una longitud de la secuencia comprendida entre 16 y 20 nucleótidos, estando dicha secuencia caracterizada porque comprende, en el centro, el polimorfismo de un solo nucleótido (PSN) específico de las variantes alélicas del gen que codifica dicho polimorfismo y dichas sondas oligonucleotídicas que hibridan con dichos alelos, en el que dicho gen es el gen Kidd y dichas sondas están constituidas por las secuencias siguientes:

a) 5' -AmC12AGT AGA TGT CCT CAA ATG-3' (SEC. ID. nº 1) ; 10 b) 5' -AmC12AGT AGA TGT TCT CAA ATG-3' (SEC. ID. nº 2) ;

o las secuencias complementarias a éstas.

2. Par de sondas según la reivindicación 1, en el que dichas sondas están conjugadas con una micropartícula o un 15 conjunto de micropartículas marcadas con por lo menos una sustancia fluorescente.

3. Utilización del par de sondas oligonucleotídicas definido en las reivindicaciones 1 y 2 para la identificación y el tipado eritrocitario genómico de por lo menos un polimorfismo de un solo nucleótido del grupo sanguíneo en individuos heterocigóticos y homocigóticos.

4. Micropartículas marcadas con por lo menos una sustancia fluorescente que presentan grupos carboxílicos en la superficie, caracterizadas porque están conjugadas con las sondas como las definidas en las reivindicaciones 1 y 2.

5. Procedimiento para la identificación y el tipado de por lo menos un polimorfismo de un sólo nucleótido (PSN) del 25 grupo sanguíneo Kidd en individuos heterocigóticos y homocigóticos, que comprende las fases siguientes:

a) extracción del ADN de una muestra biológica;

b) ampliación por RCP del fragmento de gen que comprende el polimorfismo de un sólo nucleótido del sistema 30 eritrocitario que debe analizarse por medio de cebadores específicos de los que por lo menos uno está marcado en el extremo 5' con biotina para obtener productos biotinilados de RCP;

c) conjugación del par de sondas oligonucleotídicas como se ha definido en la reivindicación 1 con una micropartícula o un conjunto de micropartículas marcadas con por lo menos una sustancia fluorescente; 35 d) hibridación de los productos de RCP biotinilados de la fase b) con los productos conjugados de la fase c) y la detección con la adición de estreptavidina-ficoeritrina;

e) detección de la fluorescencia. 40

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que los cebadores de la fase b) presentan las secuencias siguientes:

i) 5' -CAT GCT GCC ATA GGA TCA TTGC-3' Directo (SEC. ID. nº 3) ; 45 ii) 5' -GAG CCA GGA GGT GGG TTT GC-3' Inverso (SEC. ID. nº 4) .

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6, en el que el cebador i) está biotinilado en el extremo 5'.

50 8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que el conjunto de micropartículas fluorescentes son de Luminex Corporation.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que la detección de la fluorescencia se efectúa con el sistema LabMAP™. 55

10. Kit de diagnóstico para la identificación y el tipado de por lo menos un polimorfismo de un solo nucleótido (PSN) del sistema eritrocitario Kidd en individuos heterocigóticos y homocigóticos, que comprende los compuestos siguientes:

60 a) un conjunto de cebadores para la ampliación por RCP del fragmento de gen que comprende el polimorfismo de un sólo nucleótido del sistema eritrocitario considerado;

b) pares de sondas oligonucleotídicas como se definió según la reivindicación 1, conjugados con una micropartícula o un conjunto de micropartículas marcadas con por lo menos una sustancia fluorescente, pudiendo dichas 65 sondas hibridarse con dicho polimorfismo de un sólo nucleótido.

11. Kit de diagnóstico según la reivindicación 10, en el que los cebadores de la fase a) presentan las secuencias siguientes:

i) 5' -CAT GCT GCC ATA GGA TCA TTGC-3' Directo (SEC. ID. nº 3) ; ii) 5' -GAG CCA GGA GGT GGG TTT Inverso GC-3' (SEC. ID. nº 4) .

12. Kit de diagnóstico según la reivindicación 11, en el que el cebador i) está biotinilado en el extremo 5'.